基于VDR调控NF-κB信号通路探讨银屑Ⅰ号治疗寻常型银屑病的作用机制
发布时间：2017-12-29 22:13
本文关键词：基于VDR调控NF-κB信号通路探讨银屑Ⅰ号治疗寻常型银屑病的作用机制 出处：《广州中医药大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：目的:1.观察寻常型银屑病患者皮损组织VDR、NF-κB、IκB蛋白表达差异,分析蛋白表达差异与疾病严重程度、中医辨证分型的相关性,为中医辨证分型及临床用药提供客观参考依据。2.观察不同浓度银屑I号含药血清对TNF-a诱导银屑病细胞模型细胞因子(25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22)及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表达水平的影响,以初步阐明银屑I号治疗寻常型银屑病的作用机制,为银屑I号的临床推广提供理论依据。3.腺病毒转染法构建稳定VDR-/-Hacat细胞株,观察不同浓度银屑I号含药血清对靶基因沉默的Hacat细胞模型细胞因子及VDR、NF-κB、IκB蛋白、基因表达水平的影响,以深入探讨银屑I号抑制炎症反应的作用靶点,为课题组后期深层次研究奠定基础。方法:临床研究部分本课题参考寻常型银屑病的中西医诊断标准共纳入病例102人,并进行中医辨证,入组患者均来源于广州中医药大学第一附属医院皮肤科门诊及住院部,正常人皮肤组织由广大整形美容医院整形外科提供。患者签署知情同意书后,参考银屑病皮损面积及严重程度评价标准行银屑病面积及严重程度指数(Psoriasis Area and Severity Index,PASI)评分,分别对入组病例行组织病理染色及免疫组织化学检测。采用Image-proplus 6.0图像分析软件测定目标蛋白(VDR、NF-κB、IκB)积分光密度(integral optical density,IOD)。比较正常组、银屑病组 VDR、NF-κB、IκB 蛋白表达差异,分析蛋白表达与PASI评分的相关性;比较血热证、血虚证、血瘀证各组VDR、NF-κB、IκB蛋白表达差异。实验研究部分1.银屑I号含药血清对银屑病细胞模型的影响分组:空白组(BG)、模型组(MG)、银屑I号低剂量组(LD)、银屑I号中剂量组(MD)、银屑I号高剂量组(HD),其中空白组不予造模,按照常规操作细胞培养及药物干预,MG、LD、MD、HD各组均予TNF-a诱导造模,并予相应血清培养。分别采用酶联免疫吸附法(E1ISA)检测各组细胞培养上清 25HVD3、INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 浓度;实时荧光定量 RT-PCR 检测各组 VDRmRNA、NF-κBmRNA、IκBmRNA 表达水平;蛋白印迹法(WesternBlot)检测Hacat细胞VDR、NF-κB、IκB蛋白表达水平。2.VDR-/-细胞模型构建及验证分组:VDR-NC组、VDR-433组、VDR-544组、VDR-775组,慢病毒质粒均由苏州吉玛提供,遵照慢病毒转染步骤转染Hacat细胞,荧光显微镜观察病毒转染效率,RT-PCR、Western Blot法检测各组细胞VDR基因、蛋白表达量,筛选出优质、稳定VDR-/-Hacat细胞株。3.对照质粒及VDR775质粒对Hacat细胞的影响分组:空白组(BG)、模型组(MG)、对照质粒+模型组(NC-MG)、VDR775质粒+模型组(si-MG),ELISA法检测各组培养细胞模型构建及验证上清细胞因子浓度,RT-PCR、Western Blot法检测各组VDR、NF-κB、Iκ B基因、蛋白表达量。4.银屑Ⅰ号含药血清对VDR沉默前后Hacat细胞的影响分组:对照质粒+空白组(NC-BG)、对照质粒+模型组(NC-MG)、对照质粒+银屑Ⅰ号低剂量组(NC-LD)、对照质粒+银屑Ⅰ号中剂量组(NC-MD)、对照质粒+银屑Ⅰ号高剂量组(NC-HD)、VDR775质粒+空白组(si-BG)、VDR775质粒+模型组(si-MD)、VDR775质粒+银屑Ⅰ号低剂量组(si-LD)、VDR775质粒+银屑Ⅰ号中剂量组(si-MD)、VDR775质粒+银屑Ⅰ号高剂量组(si-HD),常规细胞培养24h,ELISA法检测各组培养上清细胞因子浓度,RT-PCR、Western Blot法检测各组VDR、NF-κB、IκB基因、蛋白表达量。结果:临床研究部分1.银屑病皮损组织VDR、IκB蛋白表达明显低于正常组织(P0.01),NF-κB蛋白表达明显高于正常组织(P0.01);且VDR蛋白表达量与PASI评分呈负相关(r=-0.474,P=0.000),NF-κB、IκB 表达量与 PASI 呈正相关(r=0.093,P=0.325;r=0.037,P=0.713)。2.血热组NF-κ B表达量明显高于血虚组、血瘀组;血瘀组VDR表达明显高于血热组、血虚组,NF-κB、IκB表达明显低于血热组、血虚组;血虚组VDR表达量明显低于血热组、血瘀组。实验研究部分1.银屑I号含药血清对银屑病细胞模型的影响与 BG 组比较,MG 组 25HVD3 水平显著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平显著升高(P0.01);VDR、IκB蛋白及基因表达水平明显降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达水平明显升高(P0.01)。与MG组比较,LD、MD、HD组25HVD3水平显著升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-22水平显著降低(P0.01),MD、HD组IL-17显著降低(P0.01);LD、MD、HD组VDR、I κ B蛋白表达均明显升高(P0.05),NF-κ B蛋白表达明显降低(P0.01);MD、HD组VDRmRNA表达水平均明显升高(P0.05),MD、HD 组 NF-κ B mRNA 表达水平明显降低(P0.05),LD、MD、HD 组 I κ BmRNA 表达水平均明显升高(P0.05)。2.VDR-/-细胞模型构建及验证采用VDR775质粒进行转染时,VDR基因、蛋白表达水平均低于其他质粒;MOI=100时,VDR775质粒转染效率最高,MOI=300时,VDRNC质粒转染效率最高。3.对照质粒及VDR775质粒对Hacat细胞的影响与 BG 组比较,MG 组 25HVD3 水平显著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22水平显著升高(P0.01);NF-κ B、I κ B蛋白及基因表达水平明显升高(P0.01)。与MG组比较,NC-MG组VDR、I κ B、NF-κ B蛋白及基因表达水平无明显变化(P0.05),细胞因子表达水平无显著变化(P0.05);与NC-MG组比较,si-MG组25HVD3水平显著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22 水平显著升高(P0.01),VDR、IκB蛋白表达明显降低(P0.01),VDR mRNA表达明显降低(P0.01),NF-κB蛋白、基因表达明显升高(P0.01)。4.银屑I号含药血清对VDR沉默前后Hacat细胞的影响①银屑I号含药血清对对照质粒干预Hacat的影响与NC-BG组比较,NC-MG组25HVD3 水平显著降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 水平显著升高(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表达水平均明显降低(P0.01),NF-κB蛋白、基因表达水平明显升高(P0.01)。与NC-MG组比较,NC-LD组INF-γ、IL-1、IL-4显著降低(P0.05),NF-κB显著降低(P0.01),IκB明显升高(P0.01);NC-MD组 25HVD3 明显升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17 水平显著降低(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表达显著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.05);NC-HD 组 25HVD3 明显升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17 水平显著降低(P0.01),VDR、IκB蛋白及基因表达显著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.05)。②银屑I号含药血清对WDR沉默前后Hacat的影响与si-BG组比较,si-MG组 25HVD3 明显降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 明显升高(P0.01),VDR、Iκ B蛋白及基因表达显著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.01)。与 si-MG 组比较,si-LD 组 25HVD3 明显升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17明显降低(P0.05),VDR蛋白及基因显著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.05);si-MD组25HVD3明显升高(P0.01),INF-γ、IL-4、IL-17、IL-22显著降低(P0.05),VDR、IκB蛋白表达显著升高(P0.05),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.01),IκBmRNA表达显著升高(P0.01);si-HD组25HVD3 明显升高(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 显著降低(P0.05),VDR蛋白及基因表达显著升高(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达显著降低(P0.01),I κ BmRNA 显著升高(P0.01)。③银屑Ⅰ号含药血清对VDR沉默前后Hacat细胞的影响与对应NC组比较,si-BG组 INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 显著升高(P0.01),VDR 蛋白、基因表达降低(P0.01);si-MG 组 25HVD3 明显降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22显著升高(P0.01),VDR蛋白、基因表达降低(P0.05),NF-κB蛋白及基因表达显著升高(P0.05);si-LD 组 25HVD3 明显降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22显著升高(p0.05),VDR蛋白、基因表达降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达显著升高(P0.05),I κ B蛋白显著升高(P0.01);si-MD组25HVD3明显降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-17、IL-22 显著升高(P0.05),VDR 蛋白、基因表达降低(P0.05),NF-κB蛋白及基因表达显著升高(P0.01);si-HD组25HVD3明显降低(P0.01),INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22 显著升高(P0.05),VDR 蛋白、基因表达降低(P0.01),NF-κB蛋白及基因表达显著升高(P0.01);IκBmRNA蛋白显著降低(P0.01)。结论:1.寻常型银屑病皮损中VDR、IκB表达量低于正常人,NF-κB高于正常人,且蛋白表达与中医辨证分型存在相关性,VDR信号抑制可能是银屑病发生、发展的重要原因,蛋白差异表达可为临床辨证及用药提供参考依据。2.银屑I号可促进生化因子25HVD3表达,抑制炎症因子INF-γ、IL-1、IL-4、IL-17、IL-22浓度水平,其作用机制可能与调控VDR信号、NF-κ B信号表达水平有关。3.VDR775质粒可成功转染Hacat细胞,显著抑制VDR蛋白、基因表达水平,VDR NC质粒对银屑病细胞模型生化功能无显著影响。4.成功构建野生型VDR-/-银屑病细胞模型,发现VDR沉默后NF-κ B信号表达明显升高,并且其下游炎症因子表达明显升高,VDR与NF-κB之间可能存在"串话作用",VDR可能通过调控NF-κ B表达抑制炎症反应。5.银屑Ⅰ号可促进生化因子表达,降低炎症因子水平,但与沉默前组内比较发现其抗炎作用明显减弱,表明VDR可能是银屑Ⅰ号调控NF-κ B信号通路抑制炎症反应的重要靶点之一。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R758.63
【参考文献】
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，本文编号：1352095
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