基于人冠状病毒OC43重组病毒抗病毒高通量筛选平台的建立及初步应用

发布时间：2017-12-30 02:07

本文关键词：基于人冠状病毒OC43重组病毒抗病毒高通量筛选平台的建立及初步应用　出处：《中国疾病预防控制中心》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：冠状病毒(Coronaviruses,CoVs)是目前已知基因组最大的、有包膜的单股正链RNA病毒,其病毒粒子呈球形,基因组全长27-33 kb。冠状病毒在自然界中分布广泛,在人、哺乳动物和鸟类中均已分离到该类病毒。冠状病毒在感染人和鸟类后通常引起呼吸系统疾病,但是在感染其他哺乳类动物后往往引起消化系统或者神经系统疾病。虽然在上个世纪30年代和60年代就已经分离到了第一个禽冠状病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)和第一个人冠状病毒(Human coronavirusOC43,HCoV-OC43),但是直到2003年严重急性呼吸综合征(Sever acute respiratory syndrome,SARS)在全球范围内的暴发流行以及猪冠状病毒的暴发流行给畜禽养殖业造成了重大经济损失,冠状病毒的感染才越来越受到人类医学和兽医学科专家的共同重视。此外,SARS-CoV和MERS-CoV两种动物疫原性病毒的感染也对人类生命健康构成了严重的威胁。然而,目前尚无有效的药物能够治疗冠状病毒引起的感染。因此,亟待建立一种高效的抗冠状病毒药物筛选平台用于筛选抗冠状病毒候选药物。HCoV-OC43是目前已知的能够感染人的6种冠状病毒中的一种,与人冠状病毒HKU1 (HCoV-HKU1)、SARS 冠状病毒(SARS-CoV)和 MERS 冠状病毒(MERS-CoV)同属于β群。因此其基因组与同属于β群的SARS-CoV和MERS-CoV具有极高的相似性,特别是在冠状病毒较为保守的复制酶(nsp12)和解旋酶(nsP13)区域。因此,HCoV-OC43可以作为一种不依赖于生物安全三级(Biological safety level-3, BSL3)实验室的用来筛选广谱抗冠状病毒药物的和宿主抗病毒基因的有效工具。病毒反向遗传操作技术的建立为研究病毒基因功能和筛选广谱抗病毒药物开辟了新的途径。利用反向遗传操作技术将外源报告基因插入病毒基因组中而获得的重组病毒可用于病毒编码蛋白的功能、病毒复制规律及抗病毒药物筛选等研究。本文利用反向遗传学操作技术成功获得了一株稳定、高效表达海肾荧光素酶基因(Renilla luciferase gene,Rluc)的重组冠状病毒,同时对该病毒进行了抗冠状病毒宿主基因筛选和药物筛选可行性评价。最后利用该重组病毒对药物库进行了高通量筛选(HighThroughput Screening,HTS),并成功筛选到了 38个能够在10μM药物浓度下有效抑制HCoV-OC43复制的药物。具体内容和研究结果如下:1、重组HCoV-OC43病毒的拯救与筛选通过重叠PCR的方法将Rluc基因以替换或者插入到HCoV-OC43附属基因ns2和ns12.9中,成功拯救出了 4株表达Rluc基因的重组病毒:rOC43-ns2FusionRluc、rOC43-ns2DelRluc、rOC43-ns12.9FusionRluc 和 rOC43-ns12.9StopRluc。其中重组病毒rOC43-ns2DelRluc不仅能够高效表达Rluc基因,并且病毒生长曲线和亲本病毒HCoV-OC43-WT类似。插入的外源Rluc基因在BHK-21细胞中和BALB/c小鼠颅内连续传代的过程中较为稳定。此外,该重组病毒对BALB/c小鼠的致病性也未发生改变,颅内注射能够引起小鼠100%死亡。该实验表明,重组病毒rOC43-ns2DelRluc具有高效表达Rluc基因以及遗传稳定性好等特点,同时也可以用于HCoV-OC43对小鼠的致病性研究,是理想的携带报告基因的HCoV-OC43模型。2、利用重组病毒rOC43-ns2DelRluc筛选HCoV-OC43易感细胞系研究利用rOC43-ns2DelRluc对实验室常见的28种真核细胞系进行了易感性筛选,并利用亲本病毒HCoV-OC43-WT进行了筛选结果的验证。结果发现,有18种细胞系能够感染HCoV-OC43,但是HCoV-OC43仅在5种细胞系中表现出了较强的复制能力,分别是Huh7.0、293T、BHK-21、RD和CHO细胞系,并且均在第五天达到病毒复制高峰。该实验结果为后续研究HCoV-OC43的复制规律、致病机制以及筛选抗冠状病毒宿主基因和药物提供了参考细胞系。3、利用重组病毒rOC43-ns2DelRluc筛选宿主抗冠状病毒基因利用 rOC43-ns2DelRluc 和 RNA 干扰技术(RNA interference,RNAi)对 8 个可能具有抗冠状病毒作用的宿主基因进行了筛选。结果表明,除了已报导的TRIM56外,有两个宿主因子(DDX3X和PKR)也具有抗病毒作用。其中PKR能够通过自身磷酸化在HCoV-OC43感染早期发挥抗病毒作用,但是这一磷酸化过程会随着GADD34基因的表达而消失。而DDX3X则是通过刺激Ⅰ型干扰素的产生来发挥抗HCoV-OC43复制的功能。进一步证明了 rOC43-ns2DelRluc可以作为抗冠状病毒宿主基因筛选的有效工具。4、利用重组病毒rOC43-ns2DelRluc高通量筛选抗冠状病毒药物首先利用已报导能够在细胞水平抑制HCoV-OC43复制的药物氯喹(chloroquine)和广谱抗病毒药物病毒唑(ribavirin)来验证rOC43-ns2DelRluc能否用于抗病毒药物筛选,并在96孔板中对该重组病毒能否用于高通量抗病毒药物筛选进行了评价。结果显示,氯喹在BHK-21细胞中对rOC43-ns2DelRluc和HCoV-OC43-WT都有较强的抑制效果,并且随着氯喹浓度的升高,抑制重组病毒和其亲本病毒的动力学曲线一致。此外,Z-factor计算结果显示rOC43-ns2DelRluc可用于抗冠状病毒药物高通量筛选。随后,我们利用rOC43-ns2DelRluc对药物库进行了筛选,并且成功的筛选到了 38个能够有效抑制HCoV-OC43复制的药物。综上所述,本研究首次利用反向遗传学技术构建了一株能够稳定、高效表达Rluc报告基因的重组冠状病毒rOC43-ns2DelRluc,并利用该重组病毒对HCoV-OC43易感细胞系、宿主抗病毒基因和抗病毒药物进行了筛选,为今后筛选抗冠状病毒宿主基因和药物提供了有效工具。
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【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R373

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