去泛素化酶BRCC36对慢性压力超负荷小鼠心脏的保护作用及雷公藤甲素干预的实验研究

发布时间：2017-12-30 09:48

本文关键词：去泛素化酶BRCC36对慢性压力超负荷小鼠心脏的保护作用及雷公藤甲素干预的实验研究　出处：《扬州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：人体脉管系统内血压的持续性异常升高如高血压病会引起心脏负荷的加重,从而导致心脏结构和功能的改变,如不加以行之有效的干预,最终将导致心力衰竭的发生,同时还可出现如房颤、早搏、冠心病等并发症。在慢性压力负荷作用下,心脏成纤维细胞可发生表型转化为分泌型的肌成纤维细胞或成纤维母细胞,大量增殖并分泌如Ⅰ、Ⅲ型胶原等细胞外基质(extracellular matrix,ECM),沉积于组织间隙导致心脏室壁弹性程度降低,心肌顺应性下降,心室正常舒张功能受损。此外,冠脉周围的细胞外基质过度沉积还影响氧及代谢产物的正常交换,引起的心肌缺血和能量代谢障碍会加重心肌细胞的肥大甚至凋亡坏死。心肌细胞和心脏成纤维细胞作为心脏的主要构成细胞,其生物学功能的改变是心脏在慢性压力超负荷下发生重构的主要病理学基础。对参与细胞功能改变过程中关键信号通路及相关调控分子的研究历来是全球广大学者的研究重点,对开发高血压病新型诊断和治疗手段具有重大的临床意义。在前期研究工作中,我们曾对心房钠尿肽(Atrial natriuretic peptide,ANP)的心脏保护作用进行分析,发现ANP通过结合其细胞膜A型受体(ANPR-A)促进细胞内GTP向cGMP转化,激活ANP-cGMP-PKG信号通路,可对抗慢性压力超负荷状态下心脏组织中TGF-β1信号通路过度活化所介导的心脏重构。通过2D电泳及质谱分析,发现在cGMP作用下,经典的促纤维化活性物质转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)在细胞内的主要信号分子Smad3与一种叫作BRCC36(BRCA1/BRCA2-containing complex subunit3)的去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB)相互作用显著增强。BRCC36随后与细胞骨架蛋白β2-tubulin一起,共同扣压Smad3并阻止其进入细胞核参与靶其因的调控,从而抑制TGF-β1所介导的促纤维化作用。然而,BRCC36是否能够直接与Smad3发生相互结合,以及作用的具体形式及相应的生物学效应,国内外还缺乏研究报道。去泛素化酶BRCC36是新近发现的细胞内活性物质,属于金属肽酶JAMM/MPN+家族成员,可特异性水解底物上通过K63位点连接形成的泛素链,从而降低底物的泛素化修饰水平。BRCC36在多种真核生物体内均组成性表达,可参与细胞中多种代谢反应过程,在细胞信号传导调节、DNA损伤修复过程中均发挥作用。由于我们前期研究发现BRCC36与TGF-β1/Smad3信号通路联系密切,其是否能够在慢性压力超负荷诱导的心脏病理性重构过程中通过对TGF-β1/Smad3信号通路调控而发挥心脏保护作用,现有文献报道中了解甚少。雷公藤甲素(Triptolide,TPL)是从是中草药雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook F,TwHF)的根茎叶中通过化学萃取的一种二萜内酯,其免疫调节作用和对抗机体炎症的功效明确,在我国拥有悠久的使用历史,现也常应用于辅助治疗多种慢性免疫系统疾病如肾病综合征、系统性红斑狼疮等。基于其抗炎抗增殖的特性及炎症反应和促纤维化作用在心肌重构过程中的重要性,我们通过本项实验研究从多角度初步探讨雷公藤甲素对慢性压力超负荷诱导的心脏重构的疗效及潜在的机制。为此,我们在C57BL/6雄性小鼠上使用被国际上广泛认可的横主动脉弓缩窄手术(Transverse aortic constriction,TAC)构建心脏慢性压力超负荷模型,检测心脏中BRCC36、促纤维化因子TGF-β1及相关细胞因子的表达表化;而后构建广泛性过表达BRCC36的转基因小鼠,探讨调节心脏内BRCC36对慢性压力超负荷诱导的心脏重构的影响及可能机制;其次通过原代培养C57BL/6成年小鼠的心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)及可调节细胞内BRCC36表达的重组腺病毒,在细胞水平直接探讨BRCC36与TGF-β1/Smad3信号通路的相互作用及可能环节;再次通过构建包含不同结构域的Smad3质粒转染293T细胞,进一步明确BRCC36是Smad3 UbK63位点连接泛素化修饰的功能性去泛素化酶,以及BRCC36和Smad3相互作用时可能的结构区域;最后,在整体动物水平,初步探讨雷公藤甲素对心脏重构的疗效及对BRCC36表达的影响。研究内容分为五部分:第一部分慢性压力超负荷模型的建立及BRCC36、TGF-β1相关细胞因子的表达变化目的:观察在慢性压力超负荷诱导的心脏重构过程中,BRCC36及TGF-β1相关细胞因子表达水平的动态变化过程。方法:采用TAC手术构建C57BL/6野生雄性小鼠(10-12周龄)的心脏慢性压力超负荷模型,同时设置假手术Sham组,在TAC术后的第2、4、8周进行称重、心脏超声结构及功能检测以评估造模是否成功。提取心脏组织总mRNA用于检测BRCC36、TGF-β1信号通路靶基因(cTGF、PAI-1、Periostin等)的转录变化;提取心脏组织总蛋白用于检测BRCC36、TGF-β1及胞内主要信号分子Smad3总表达水平(t-Smad3)及磷酸化(p-Smad3)比例及凋亡相关蛋白表达情况;免疫组织化学染色、Masson染色、TUNEL凋亡染色染色观察心脏组织病理性重构的特征性改变。结果:对比各组小鼠的心脏M型超声测量结果,TAC手术后心脏出现向心性肥大,多项心脏收缩舒张功能指标恶化,提示慢性压力超负荷诱导的心脏病理性重构模型建立。多种组织染色显示心肌细胞肥大,心肌间质胶原纤维沉积明显,心脏凋亡细胞增多。蛋白印迹结果显示TAC术后心脏组织中BRCC36表达水平下降,同时检测到促纤维化因子TGF-β1表达水平增强,p-Smad3水平明显增高,但t-Smad3水平无明显改变;促凋亡蛋白Puma、Bad表达上调,促存活蛋白Bcl-2、Mcl-1表达下调,并随压力负荷持续时间的延长而更为明显。qPCR 结果显示 TGF-β1/Smad3 信号通路下游基因 cTGF、PAI-1、Periostin、α-SMA mRNA转录水平升高,提示慢性压力超负荷可诱导TGF-β1/Smad3信号通路激活。结论:在慢性压力超负荷诱导的心脏重构过程中,促纤维化因子TGF-β1及Smad3的活化是介导这一过程的重要因素,同时证实去泛素化酶BRCC36的表达发生了显著的动态变化,提示BRCC36可能参与了慢性压力超负荷诱导的心脏重构过程,与TGF-β1/Smad3信号通路存在一定的相关性。第二部分BRCC36参与慢性压力超负荷诱导的心脏重构的机制研究目的:明确BRCC36在慢性压力超负荷诱导的心脏重构中的可能作用机制。方法:构建广泛过表达BRCC36的转基因小鼠并基因鉴定,采用TAC手术构建心脏慢性压力超负荷模型,术后8周通过心脏超声评估心脏结构和功能的改变。通过免疫组织化学染色、Masson染色、TUNEL凋亡染色法评价BRCC36对慢性压力超负荷诱导的心脏重构的保护作用,通过qPCR、免疫印迹、免疫共沉淀来检测BRCC36对心脏内TGF-β1/Smad3信号通路及下游靶基因cTGF、PAI-1、Periostin、α-SMA表达的影响,以及对该通路内重要信号分子Smad3总表达水平、磷酸化水平及泛素化水平的影响并检测凋亡相关蛋白的表达变化,进一步探讨BRCC36可能的心脏保护机制。结果:通过对基因组DNA进行特异性扩增提示过表达BRCC36小鼠构建成功,并检测到心脏组织中BRCC36显著过表达。相较于野生手术鼠,心脏超声结果显示心脏内过表达BRCC36能够缓解慢性压力超负荷诱导的左心室向心性肥厚,改善心室机械功能,提高心脏泵血效率。Masson染色显示心脏间质胶原纤维沉积缓解,以心脏成纤维细胞分泌的I、IH型胶原减少为主。HE染色显示心肌细胞肥大改善,心肌纤维正常结构被破坏程度下降。免疫印迹结果显示上调心脏内BRCC36的表达并不能减少慢性压力超负荷诱导的TGF-β1、t-Smad3在心脏组织中含量的增高,但能够降低p-Smad3的比例,从而抑制促纤维化TGF-β1/Smad3通路的过度激活及下游靶基因cTGF、PAI-1、Periostin、α-SMA的转录,同时检测到Smad3 UbK63位点连接泛素化修饰水平的降低。此外,心脏内过表达BRCC36可缓解慢性压力超负荷诱导的心脏细胞凋亡,抑制心脏促凋亡蛋白Puma、Bad表达,增强促存活蛋白Bcl-2、Mcl-1表达。结论:心脏内过表达BRCC36对慢性压力超负荷诱导的心脏重构具有保护作用,这一作用可能与抑制TGF-β1/Smad3通路的激活以及促进心肌细胞存活和减少细胞凋亡有关。BRCC36对Smad3的调控与改变Smad3 UbK63泛素化修饰水平有相关性。第三部分BRCC36对TGF-β1/Smad3信号通路调节的机制研究目的:探讨BRCC36对TGF-β1/Smad3信号通路调控的具体作用环节及生物学效应。方法:构建消减/过表达BRCC36的重组腺病毒并体外感染原代培养的成年小鼠心脏成纤维细胞,改变细胞内BRCC36表达水平,采用qPCR、免疫印迹、免疫荧光染色、细胞增殖实验等,观察BRCC36对TGF-β1诱导的Smad3 Ser423/425位点磷酸化、Smad3 UbK63位点泛素化、Smad3入核、靶基因转录调控、CFs增殖及向MFs转化的影响,进一步探讨BRCC36对TGF-β1/Smad3信号通路的具体调节机制。结果:TGF-β1可显著引起基于胞内信号分子Smad3介导的通路活化,p-Smad3程度在给药后30分钟时间点测得最大值,TGF-β1刺激心脏成纤维细胞12小时后可反馈性诱导BRCC36表达升高,同时伴随通路活化水平的下降,提示BRCC36可能是TGF-β1/Smad3信号通路的一种内源性负向调控因子。与转染空载腺病毒的心脏成纤维细胞相比,细胞内过表达BRCC36能够抑制TGF-β1诱导的p-Smad3产生,降低Smad3 UbK63位点连接泛素化修饰水平。免疫荧光显示BRCC36可抑制Smad3入核,其下游靶基因cTGF、PAI-1、Periostin、α-SMA mRNA转录水平明显下降,TGF-β1诱导的CFs增殖及向MFs转化也一定程度被抑制。结论:去泛素化酶BRCC36通过降低Smad3 UbK63位点连接泛素化修饰水平,可抑制TGF-β1诱导的p-Smad3生成及后续信号入核,从而负向调控TGF-β1/Smad3信号通路,最终表现为抑制心脏成纤维细胞的复制增殖、转化为肌成纤维细胞及促纤维化相关基因的表达。BRCC36还能够被TGF-β1诱导性表达升高,从而负向调节TGF-β1/Smad3信号通路的激活。第四部分BRCC36与Smad3相互作用的机制研究目的:明确BRCC36与Smad3相互作用时的可能结构区域。方法:构建包含全长及不同结构域的Smad3质粒,分别与BRCC36质粒共转染293T细胞,运用免疫共沉淀方法明确BRCC36与Smad3相互作用的可能结构域。结果:免疫共沉淀显示,仅在包含有MH2结构域Smad3片段质粒的沉淀物中,检测到去泛素化酶BRCC36信号条带。去泛素化分析显示BRCC36可显著降低包含MH2结构域Smad3片段的UbK63位点泛素化修饰水平。结论:BRCC36可通过与Smad3 MH2结构域直接结合发挥其UbK63位点连接泛素化修饰的去泛素化作用。第五部分雷公藤甲素对心脏重构的疗效及对BRCC36表达水平的影响目的:观察雷公藤甲素对慢性压力超负荷诱导的心脏重构的疗效以及是否与调节BRCC36表达有关。方法:C57BL/6雄性小鼠接受TAC手术造模6周后,随机分为安慰剂组、低剂量雷公藤甲素治疗组(20ug/kg/day)和高剂量雷公藤甲素治疗组(100ug/kg/day),同时设立假手术安慰剂组进行对照。通过免疫组织化学染色、天狼星红染色、qPCR、免疫印迹等方法评价雷公藤甲素对慢性压力超负荷诱导的心脏重构的疗效,初步探讨雷公藤甲素的疗效是否与调节BRCC36表达有关。结果:与TAC组相比,雷公藤甲素可改善慢性压力超负荷诱导的心脏结构变化及心脏功能恶化;抑制促纤维化因子TGF-β1过度激活介导的心脏重构,缓解心脏组织内Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的沉积及心肌细胞肥大;降低NLRP3炎症小体的表达水平,抑制心脏组织促炎介质的表达及炎性细胞浸润;同时检测到雷公藤甲素可诱导BRCC36表达水平的提高。结论:雷公藤甲素可改善慢性压力超负荷诱导的心脏重构,其机制可能与抑制NLRP3炎症小体的表达,抑制TGF-β1/Smad3信号通路有关。雷公藤甲素对TGF-β1/Smad3信号通路的抑制作用与上调BRCC36的表达,增强BRCC36对TGF-β1/Smad3信号通路的负向调控密切相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R544.1

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