VEGF125-136小肽标记CY5.5及钆剂体内外靶向荧光及MRI实验研究

发布时间：2017-12-30 20:18

本文关键词：VEGF125-136小肽标记CY5.5及钆剂体内外靶向荧光及MRI实验研究　出处：《南方医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的一、实验组VEGF125-136小肽QS及对照组随机小肽QK合成。二、QS及QK小肽活性检测,为进一步荧光及MRI靶向探针制备及靶向成像奠定前期基础。三、cy5.5-QS及cy5.5-QK合成,为下一步靶向荧光成像奠定基础。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像,观察其对BEL-7402细胞靶向性。五、QS-Gd及QK-Gd合成,为进一步MRI靶向成像奠定基础。六、QS-Gd及QK-Gd体内外MRI成像,观察其对BEL-7402细胞靶向性。方法一、VEGF125-136小肽QS及随机小肽QK合成固相合成微球小肽QS及QK。二、ELISA法检测QS及QK小肽活性三、cy5.5-QS 及 cy5.5-QK 合成取实验组QS与对照组QK放入固相合成器中标记A与B,氨基脱保护后加CY5.5-NHS、DIPEA反应3小时。TFA切割、乙醚真空沉淀,HPLC纯化、干燥、质谱。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像1、BEL-7402细胞体外荧光靶向实验(1)免疫荧光成像制备BEL-7402细胞爬片,加入VEGFR-2荧光抗体,DAPI复染细胞核,共聚焦显微镜观察VEGFR-2受体表达情况。(2)细胞荧光实验制备BEL-7402细胞爬片,实验组加CY5.5-QS,对照组加CY5.5-QK,DAPI复染细胞核,共聚焦显微镜观察各组细胞荧光成像异同。2、BEL-7402细胞体内荧光靶向实验(1)荷瘤鼠模型制备(2)活体荧光成像实验实验组注射QS-CY5.5,对照组注射QK-Cy5.5,多时间点采集图像,选感兴趣区测量荧光强度。五、QS-Gd及QK-钆合成QS实验组与QK对照组氨基脱保护后加入DOTA-tris、HBTU、HOBT,DIPEA 500 ul,350转/分,2小时。FA切割,乙醚沉淀,分别加入乙酸钆82mg,油相内合成,50度,PH始终保持在6.5,24小时。离心收集上清,冻干,HPLC纯化并质谱分析。六、VEGF125-136-Gd体内外MRI成像(1)QS-Gd及QK-Gd体外细胞MRI靶向实验BEL-7402细胞为实验组与对照组,实验组加入递增浓度的QS-Gd,对照组加入等量QK-Gd,37.5℃培养箱内6小时。PBS实验组清洗后各组细胞消化酶各1ml消化1-2分,吸入离心管内,每管1.5ml,加入2%琼脂糖悬浮。3.0MRI扫描,ROI=2mm,测量计算SNR。(2)QS-Gd及QK-Gd体内MRI靶向实验实验尾静脉注射QS-Gd(0.2mmolGd/kg),对照组尾静脉注射等量QK-Gd。多时间点扫描,ROI直径约2.0mm,测量计算SNR。(3)BEL-7402 HE染色及VEGFR2免疫组化结果一、VEGF125-136小肽QS及随机小肽QK合成实验组QS小肽分子量为1815.87,对照组QK小肽分子量1689.95,符合理论分子量,合成正确。二、ELISA法检测QS及QK小肽活性QS小肽体外有很强结合VEGFR2受体能力。三、cy5.5-QS 及 cy5.5-QK 合成QS-Cy5.5经质谱仪分析分子量2193.16,QK-Cy5.5经质谱仪分析分子量2067.94,合成正确。四、cy5.5-QS及cy5.5-QK体内外荧光成像1.免疫荧光实验实验显示BEL-7402细胞膜有较多绿色荧光物质FITC-VEGFR2抗体。2.细胞荧光实验CY5.5-QS实验组BEL-7402细胞膜膜及细胞核细胞膜融合图像可见大量靶向红色荧光物质CY5.5-QS:CY5.5-QK对照组未见明显红色荧光标记。3.体内荧光实验实验组尾静脉给药CY5.5-QS,荧光信号迅速上升,5分钟达第一峰值后开始下降,60分钟信号再次上升,2小时信号达最大值,为第二靶向峰值,然后再次下降,4小时接近平扫。对照组尾静脉给药CY5.5-QK,荧光信号迅速上升,5分钟达峰值,后迅速下降,未见信号再次上升。五、VEGF125-136-Gd及随机小肽-钆合成实验组QS-Gd经质谱仪分析分子量为2133.795,驰预率1/T1 = 7.79 mM-1s-1。对照组QK-Gd经质谱仪分析分子量为2264.348,驰预率1/T1= 7.46 mM-1s-1.六、QS-Gd及QK-Gd体内外MRI成像1.QS-Gd及QK-Gd体外细胞MRI靶向实验QS-Gd实验组强化明显高于对照组QK-Gd,且随加入靶向钆剂增多强化增强,对照组QK-Gd未见明显强化。2.QS-Gd及QK-Gd体内MRI靶向实验实验组尾静脉给药QS-Gd(0.2 mmol Gd/kg),T1信号迅速上升,5分钟达第一峰值后开始下降,60分钟信号再次上升,2小时信号大最大值,然后再次下降,4小时接近平扫。对照组尾静脉给药QK-Gd,T1信号迅速上升,5分钟达峰值,后迅速下降,未见信号再次上升。3.免疫组化实验BEL-7402细胞膜表面有丰富的VEGFR2受体表达。结论1.成功合成实验组QS小肽及对照组QK小肽。2.QS小肽体外有很强结合VEGFR2受体活性。3.成功合成 cy5.5-QS 及 cy5.5-QK,cy5.5-QS 纯度为 99.65%,cy5.5-QK 纯度为 70.25%。4.免疫荧光实验表明BEL-7402细胞膜VEGFR2受体阳性。体内外细胞荧光实验显示cy5.5-QS可以BEL-7402细胞膜VEGFR2受体为靶点靶向荧光成像。5.成功构建QS-Gd及QK-Gd,对比剂理化性质符合体内外T1增强需要。6.BEL-7402腋下肿瘤模型制作成功。体内外MRI实验表明QS-Gd可以BEL-7402细胞膜VEGFR2受体为靶点靶向MRI成像。
[Abstract]:Objective : To study the targeting ability of QK and QS - Gd and cy5.5 - QK . In vitro fluorescence imaging of BEL - 7402 cells was carried out . ( 2 ) In vivo fluorescence imaging experiment group , QS - CY5.5 was injected into the experimental group . The results showed that the concentration of QS - Gd and QK - Gd in the control group were all kept at 6.5 and 24 hours . The molecular weight of QS - Gd and QK - Gd in the experimental group were measured by mass spectrometer . The results showed that the expression of VEGFR2 receptor in BEL - 7402 cell membrane was 99.65 % , cy5.5 - QS purity was 99.65 % , cy5.5 - QS purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % , cy5.5 - QK purity was 99.65 % .

【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R445.2

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