广西β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断技术平台建立及临床应用研究

发布时间：2018-01-02 05:23

  本文关键词：广西β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断技术平台建立及临床应用研究　出处：《广西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分广西人群β珠蛋白基因15个STR基因座的遗传多态性研究目的研究与β珠蛋白(β-globin,HBB)基因紧密连锁的15个短串联重复序列(short tandem repeat,STR)基因座在广西人群中的遗传多态性,为建立β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)的单体型分析技术(preimplantation genetic haplotyping,PGH)提供实验依据。方法采集广西地区150名无关个体的外周静脉血,提取外周血基因组DNA,通过荧光PCR技术扩增与β珠蛋白基因紧密连锁(距离HBB基因1Mb)的15个STR基因座(HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338),扩增产物使用ABI3500Dx遗传分析仪进行毛细管电泳,结果用Genemaper 4.1软件进行分析。最后利用Microsoft Excel软件计算15个HBB-STR基因座的等位基因频率分布以及多态信息量(polymorphism information content,PIC)等。结果在这15个HBB-STR基因座(HBB4506、D11S988、HBB4677、D11S2362、HBB5089、D11S1243、HBB5138、HBB5178、HBB5205、D11S1760、HBB5576、HBB5655、HBB5820、HBB5859、D11S1338)上分别检出18、24、22、11、18、27、13、13、16、23、22、16、17、18和7个等位基因,等位基因频率从0.003333到0.383333不等。这15个HBB-STR基因座的多态信息量(PIC)分别为0.8457、0.8983、0.8931、0.7592、0.8698、0.9046、0.7940、0.7925、0.7708、0.9102、0.8583、0.8467、0.7438、0.8366和0.7704。这15个基因座的PIC均0.7000,平均值为0.8329,其中PIC0.8500的HBB-STR基因座有6个。结论本研究检测的这15个HBB-STR基因座在广西人群中的多态信息量(PIC)较高,具有高度的遗传多态性,在建立β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断(PGD)的单体型分析(PGH)技术中具有较高的应用价值,为后续工作的开展提供了实验依据。第二部分β地中海贫血胚胎植入前遗传学诊断中不同诊断方法的比较目的对β地贫PGD中两种遗传学诊断方法——反向点杂交(reverse dot blot,RDB)结合STR单体型分析技术与二代测序(Next generation sequencing,NGS)技术,从诊断时间、确诊率、费用等方面进行对比研究,建立最适宜的遗传学诊断技术应用于广西地区β地贫PGD。方法选择双方均为β地中海贫血基因突变携带者、有PGD指征且同意参加本研究的的夫妇。患者夫妇及另外三名家系成员(女方母亲、男方母亲和男方父亲)一同抽取外周静脉血进行15个STR位点的家系连锁分析。患者经过常规的药物促排卵、取卵、取精、卵胞浆内单精子注射(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)、胚胎培养等程序,将所得胚胎全部进行囊胚培养,形成囊胚后,取囊胚期数个(5-8个)滋养外胚层细胞活检,活检后即将所有囊胚行玻璃化冷冻。利用多重置换扩增(Multiple displacement amplification,MDA)法对滋养外胚层细胞进行全基因组扩增(Whole genome amplification,WGA)。MDA扩增产物一部分采用反向点杂交(RDB)结合15个短串联重复序列(STR)位点的单体型分析(PGH)技术进行遗传学诊断(A组);另一部分MDA扩增产物采用二代测序(NGS)方法进行诊断(B组)。比较两种方法的检出率、诊断符合率、所需时间和费用等。待诊断结果出来后选择最合适的囊胚进行解冻移植。结果纳入本研究的患者获卵24个,胚胎13个,囊胚培养后形成6枚囊胚(囊胚评分分别为4BB,4BC,3CC,3CC,3BC,3CC),每个囊胚取滋养外胚层细胞活检,6例样本MDA法扩增均扩增成功,扩增成功率100%。A组中,囊胚1地贫基因型诊断结果为β-28/βCD41-42;囊胚2地贫基因型诊断结果为βCD41-42/βN;囊胚3地贫基因型诊断结果为βN/βN;囊胚4的地贫基因型诊断结果为β-28/βN/βN;囊胚5和6的地贫基因型诊断结果均为β-28/βN。B组的地贫基因型诊断结果与A组完全一致,B组同时对囊胚2-6进行染色体拷贝数检测,诊断出囊胚2为整倍体,囊胚3-6均为非整倍体。A组所需诊断时间为2-3天,结果分析所需时间约为1个工作日;B组所需诊断时间为2-3天,结果外送嘉宝仁和公司分析,所需时间为7个工作日。A组费用为2000元/囊胚,而B组费用为3500元/囊胚。最后选择囊胚2解冻移植,遗憾的是未获得临床妊娠。结论与二代测序(NGS)技术相比,反向点杂交结合STR单体型分析技术也能在β地中海贫血PGD中有效、准确地诊断出植入前囊胚的地贫基因型,能够应用于β地贫PGD临床。虽然目前二代测序价格昂贵、结果分析人员要求高,临床推广应用受限,但NGS是PGD遗传学诊断技术的发展方向和未来趋势。然而考虑到目前各方面条件的限制以及在广西地区开展β地贫PGD的急切需求,RDB结合15个STR位点单体型分析的诊断方法更加适合目前的广西地区β地贫PGD,值得推广应用。第三部分MDA结合RDB及STR单体型分析在β地贫PGD中的临床应用研究目的研究多重置换扩增(MDA)结合反向点杂交(RDB)及短串联重复序列(STR)单体型分析技术在β地贫PGD中的临床应用。方法纳入8对双方均为β地中海贫血基因突变携带者且要求进行β地贫PGD治疗的夫妇。携带者夫妇及其双方父母(每个家系一共6名成员)均抽取外周静脉血进行15个STR位点的家系连锁分析。患者经过常规的药物促排卵、取卵、取精、卵胞浆内单精子注射(ICSI)、胚胎培养等程序,将所得胚胎全部进行囊胚培养,形成囊胚后,取囊胚期数个(5-8个)滋养外胚层细胞活检,活检后即将所有囊胚进行玻璃化冷冻。利用多重置换扩增(MDA)法对取得的滋养外胚层细胞进行全基因组扩增(WGA)。MDA扩增产物采用反向点杂交(RDB)结合15个短串联重复序列(STR)位点的单体型分析(PGH)技术进行遗传学诊断。待诊断结果出来后,结合致病基因遗传学诊断结果和囊胚评分,选择最佳囊胚进行解冻移植,妊娠后孕18-22周通过羊水产前诊断进一步验证PGD诊断结果。结果这8对夫妇,β地中海贫血基因突变类型分别为CD41-42/N、CD17/N、-28/N或IVS-II-654/N。每个家系6名成员检测15个STR位点后结果显示每个家系均有7个或以上(HBB基因上游或下游均有2个以上)的STR位点可以提供诊断信息,单体型构建成功。患者经过常规药物促排卵,取卵、卵胞浆内单精子注射(ICSI)后共获得147枚胚胎,形成86枚囊胚,囊胚形成率58.50%。其中82枚囊胚扩增成功,扩增成功为95.35%。80枚囊胚获得了明确诊断,其中24枚囊胚为正常纯合子;38枚囊胚诊断为杂合子;18枚囊胚为不能移植的异常纯合子或双重杂合子。8例患者中一共4例患者进行了囊胚解冻移植(例1、例2、例3和例6),均为单囊胚移植。其中3例(例1、例2和例3)获得妊娠,1例(例6)未妊娠。妊娠率为75%(3/4)。例1和例2患者移植正常纯合子囊胚(基因型βN/βN),中孕期羊水产前诊断结果与PGD诊断结果相符。例3患者移植杂合子囊胚(基因型为βCD41-42/βN),移植后获得妊娠,但目前还未行产前诊断验证PGD诊断结果。结论本研究建立的β地贫PGD方法——即经多重置换扩增(MDA)后,反向点杂交(RDB)结合短串联重复序列(STR)单体型连锁分析,经验证有效、准确,可以在广西地区β地贫PGD临床中推广应用。我们期待着更大样本量的研究证实。
[Abstract]:The first part of the Guangxi population of beta globin gene 15 STR loci genetic polymorphism to study with beta globin (beta -globin, HBB) gene is closely linked to the 15 short tandem repeat (short tandem, repeat, STR) loci in Guangxi population genetic polymorphism for beta thalassemia embryos preimplantation genetic diagnosis (preimplantation genetic diagnosis, PGD) haplotype analysis technology (preimplantation genetic haplotyping, PGH) to provide experimental basis. Methods to collect the Guangxi area in 150 unrelated individuals of peripheral blood genomic DNA from peripheral blood, amplified by fluorescent PCR and beta globin gene (HBB gene linked distance 1Mb) of the 15 STR loci (HBB4506, D11S988, HBB4677, D11S2362, HBB5089, D11S1243, HBB5138, HBB5178, HBB5205, D11S1760, HBB5576, HBB5655, HBB5820, HBB5859, D11S1338), the PCR products By capillary electrophoresis with ABI3500Dx genetic analyzer. The results were analyzed using Genemaper 4.1 software. The final calculation of 15 HBB-STR allele frequency distribution and polymorphism information content using Microsoft Excel software (polymorphism information, content, PIC). Results in the 15 HBB-STR loci (HBB4506, D11S988, HBB4677, D11S2362, HBB5089 D11S1243, HBB5138, HBB5178, HBB5205, D11S1760, HBB5576, HBB5655, HBB5820, HBB5859, D11S1338, 18,24,22,11,18,27,13,13,16,23,22,16,17,18) were detected and 7 alleles, allele frequencies from 0.003333 to 0.383333 dollars. The polymorphic information content of 15 HBB-STR loci (PIC) were 0.8457,0.8983,0.8931,0.7592,0.8698,0.9046,0.7940,0.7925,0.7708,0.9102,0.8583,0.8467,0.7438,0.8366 and 0.7704. 15 gene the seat of PIC was 0.7000, the average value is 0.8329, PIC0.85 The HBB-STR locus was 00 with 6. The 15 HBB-STR loci detected the conclusions of this study in Guangxi population of polymorphism information content (PIC) high and has high genetic polymorphism, in the establishment of beta thalassemia preimplantation genetic diagnosis (PGD) haplotype analysis (PGH) has a high application value in the technology, provides the experimental basis for the follow-up work. The aim of the second part of beta thalassemia preimplantation genetic diagnosis in different diagnosis of beta thalassemia PGD two genetic diagnosis methods -- reverse dot blot (reverse dot, blot, RDB) with the combination of technology and the two generation sequencing analysis of STR haplotype (Next generation sequencing, NGS) technology, from the time of diagnosis, diagnosis rate, cost and other aspects of comparative study, establish the most suitable application of genetic diagnosis technology for PGD. beta thalassemia in Guangxi area to choose both beta Thalassemia gene mutation carriers, PGD indications and agreed to participate in the study. The couple with the couple and three other family members (the woman's mother, his mother and his father) linkage analysis with venous blood of 15 loci of STR. Patients after routine ovulation drugs, take eggs, sperm and intracytoplasmic sperm injection (Intracytoplasmic sperm, injection, ICSI), embryo culture and other procedures, the embryo blastocyst culture, blastocyst formation, and blastocyst number (5-8) trophectodermal cell biopsy biopsy after all the blastocyst vitrification for use. Multiple displacement amplification (Multiple displacement, amplification, MDA) method on trophoblast cells were derived from outside the whole genome amplification (Whole genome amplification, WGA.MDA) amplified part of using reverse dot blot (RDB) combined with 15 short string 鑱旈噸澶嶅簭鍒，

本文编号：1367866