菊非药用部位多糖类物质干预炎症性肠病的效应机制研究

发布时间：2018-01-03 06:23

本文关键词：菊非药用部位多糖类物质干预炎症性肠病的效应机制研究　出处：《南京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：菊属药用植物资源的利用目前主要以其头状花序中的黄酮类、挥发油及有机酸类化合物的研究为主,而对菊属植物中多糖等大分子物质的研究相对粗浅,主要涉及其多糖的提取、分离、简单纯化及活性筛选等,其中对菊非药用部位多糖的研究则仅有本团队前期的初步研究工作。根据课题组前期预实验结果,表明菊根、茎、叶总多糖的含量远远高于菊花中的含量(81.0%vs 8.62%),在经水提醇沉、sevage法除蛋白之后,菊非药用部位多糖表现出抗氧化、抗凝血、抗肿瘤细胞生长、神经保护作用、调节肠道菌群的生长以及对结肠炎小鼠的保护作用等生物活性,鉴于此,本课题以原有工作基础为背景,对菊非药用部位多糖干预炎症性肠病的效应进行进一步验证,并对其可能存在的机制进行探讨,基于此活性导向性,对菊非药用部位多糖进行提取、分离、纯化以及结构的表征,为深入开展菊非药用部位多糖的研究利用奠定科学依据。本论文共分四章节内容。一、文献研究本部分在对相关文献进行整理、归纳和总结的基础上,系统总结了菊多糖的结构特征、分离与鉴定方法及菊多糖生物活性的研究现状,以期为开展菊非药用部位多糖的活性与结构研究提供科学参考。同时,对多糖类物质对机体肠道屏障功能紊乱及其引发的相关疾病的干预和治疗作用进行梳理和总结,为开展菊非药用部位多糖干预炎症性肠病-结肠炎的效应机制研究提供理论支撑。二、实验研究(一)菊非药用部位多糖类物质资源价值发现1.多糖类物质免疫调节作用和抑制肿瘤细胞生长研究1.1本实验采用免疫抑制剂环磷酰胺来复制小鼠免疫功能低下模型,用以考察菊非药用部位多糖对其诱导的免疫抑制小鼠的免疫调节作用,结果表明,菊多糖JFP能显著提升免疫低下小鼠的的胸腺指数和脾脏指数,能明显增强小鼠巨噬细胞的吞噬活力,使单位时间内血液中碳粒清除速率加快,表明JFP对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的免疫功能具有一定程度的保护和改善作用。1.2应用MTT细胞增殖检测法测定样品对人肠癌细胞体外增殖的影响。结果表明,JFP对人肠癌细胞LOVO,HCT-116,SW480和CAC02的生长具有一定程度的抑制作用,进一步验证,JFP对炎症性肠病改善的积极作用,为将来开发利用菊非药用部位多糖提供科学依据。2.结肠炎模型的建立及多糖类物质的效应评价2.1采用TNBS/乙醇灌肠方法成功诱导了大鼠结肠炎,表现在造模后大鼠出现体重下降、稀水便及血便。结肠外观及组织病理学检测可见结肠增厚、溃疡形成,并且MPO活性较正常对照组显著升高。JFP中、低剂量(100、50mg/kg)干预两周后,对其肠炎症状具有较好的缓解作用,可回调结肠炎大鼠体重及DAI值,可减轻结肠外观及镜下炎症病变,且显著降低MPO酶活性(P0.05)。高剂量组(200 mg/kg)大鼠炎症症状,大鼠结肠外观损伤及MPO活性略有下降,但与模型组相比,无统计学意义。此外,多糖组显著降低结肠组织黏膜中TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-6、IL-1 β和IL-23的含量,同时提升IL-13、IL-10和IL-4的水平,尤其以中、低剂量效果更为显著。结果提示,不同剂量JFP对大鼠结肠炎的疗效存在差异,中、低剂量优于高剂量,与阳性治疗药柳氮磺胺吡啶接近。2.2采用DSS法成功建立了 C57BL6小鼠急性溃疡性结肠炎模型,考察了 JFP不同剂量、不同给药方式对模型小鼠结肠炎的影响。结果显示,中、低剂量多糖组对模型小鼠的炎症反应具有较好的改善作用,尤其以边造模边给药的方式为佳。具体表现为降低炎症小鼠DAI、缓解病理组织损伤、降低组织学评分,改善肠炎小鼠腹泻、便血状况,降低结肠组织MPO活性、NO含量,回升组织SOD活性等。(二)菊非药用部位多糖干预结肠炎的效应机制研究1.菊非药用部位多糖对结肠炎大鼠肠道微生态的调节作用1.1基于细菌16S V3-V4可变区,利用Illumina/Miseq二代测序技术平台进行高通量测序技术及生物信息学分析方法,研究JFP对TNBS诱导结肠炎大鼠肠道菌群结构的影响。结果表明,与正常组相比,模型组大鼠肠道菌群组成发生明显变化,其中Firmicutes/Bacteroidetes比例显著降低,而多糖的摄入明显改善了这种趋势,Firmicutes数量增多,二者比值回升,基本维持了肠道菌群的生态平衡。此外,病原微生物如Escherichia、Enterococccs和prevotella的相对丰度显著降低,有益微生物如Butyricicoccus、Clostridium、Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Lactobacillus和Bifidobacterium的相对丰度明显增加。通过肠道菌群与生化因子的关联分析,发现Butyricicoccus、Clostridium、Lachnospiraceae、Rikenellaceae、Lactobacillus、Bifidobacterium等有益菌与抗炎因子 IL-4、IL-10、IL-11 呈显著正相关(P0.01),而 Prevotella、Ruminococcus、Bacteroides、Escherichia-Shigella、Akkermansia、Turicibacter等有害菌与 IL-23、TNF-α、IL-1β、IL-6、IF-17、IFN-γ 等促炎因子水平呈显著正相关(P0.01)。同时,基于COG数据库和KEGG数据库对肠道菌群的相关生化功能进行预测,主要涉及氨基酸代谢、细胞运动、信号转导、能量代谢、葡聚糖生物合成与代谢、脂代谢、细胞膜转运、辅酶和维生素代谢、神经系统、转录、细胞生长和调亡等多种生理功能,在上述功能中,正常组与模型组在能量代谢、辅酶转运与代谢、转录、细胞壁/膜的合成、信号转导等方面有较为明显的差异,模型动物在摄入多糖后,这些差异的生理功能均有接近正常组的趋势,尤以中、低剂量给药组更为显著。本实验研究从不同分类学水平上发掘对菊非药用部位多糖起响应的关键菌属,分析JFP对结肠炎大鼠症状的改善作用,评价菊非药用部位多糖对结肠炎的干预效应,为中药多糖在治疗炎症性肠病的药物研究与应用方面提供新的思路。1.2采用GC-FID分析方法,测定了结肠炎大鼠肠道内容物中SCFAs的含量变化,结果表明,JFP在不同程度上增加了结肠炎大鼠肠道内SCFAs的含量,其中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸的含量在模型动物肠道内显著升高,该结果与肠道菌群多样性的变化较为一致,提示:JFP可能通过改善结肠炎大鼠肠道菌群的失衡,恢复肠道菌群的代谢功能,增强肠道菌群产生SCFAs的能力,从而缓解和改善结肠炎的症状。2.菊非药用部位多糖干预炎症性肠病的分子机制研究2.1研究证实,上皮屏障功能受损,导致肠道细菌和其它抗原渗透进入肠道黏膜是炎症性肠病发病的主要因素之一。在本章节研究中,我们选择Claudin、Occludin与ZO-1作为研究对象,分析其在大鼠结肠黏膜组织中的表达情况,结果表明,肠黏膜上的Claudin-1、Occludin与ZO-1在正常组大鼠体内均有较高的表达,模型组大鼠肠道上述蛋白的表达明显降低,而模型组大鼠给予菊非药用部位多糖后,提高了 Claudin-1、Occludin与ZO-1在mRNA与蛋白水平上的表达,尤以中、低剂量组的效果更为显著。结合前后研究结果我们推测,菊多糖通过调控肠道菌群多样性,恢复肠道生物屏障的保护功能,使得肠道黏膜上皮细胞上的某些紧密连接蛋白的表达水平恢复正常,进而增强肠道黏膜的屏障功能,缓解和改善TNBS诱导的结肠炎大鼠症状。2.2大量研究证实,机体肠道微生态平衡的打破与炎症性肠病的发生发展密切相关。炎症性肠病患者存在肠道菌群失调,保护性微生物和侵袭性微生物生态平衡被打破,在各种微生物抗原刺激下,体内免疫系统被过度激活,各种炎症细胞活化,导致细胞因子的失衡,产生肠道慢性炎症反应。本章节围绕TLR4/NF-κ B信号通路,利用qPCR和western blot技术分别从基因和蛋白水平检测了 NF-κB、TLR4的表达水平。qPCR结果显示,与正常大鼠相比,模型大鼠结肠组织黏膜NF-κB、TLR4表达水平均显著提高,且具有统计学意义。而不同剂量菊非药用部位多糖对模型大鼠黏膜组织NF-κB、TLR4mRNA表达水平具有不同程度的回调作用;Western blot结果显示,与正常大鼠相比,模型大鼠结肠组织黏膜p65及其磷酸化pp65、TLR4蛋白表达水平均显著提高,多糖不同剂量组对结肠炎大鼠黏膜组织p65及其磷酸化pp65表达水平具有不同程度的回调作用,尤其是对P65蛋白表达水平的降低具有极显著差异。上述研究结果提示,菊非药用部位多糖可通过阻断TLR4/NF-κB通路途径,抑制TLR4、NF-κB的表达,继而减轻肠道炎症反应。此外,开展了 JFP对IL-6/STAT3信号通路的影响研究,分别从基因和蛋白水平检测了 IL-6、JAK2、STAT3基因转录水平及STAT3、p-STAT3、p-JAK2蛋白表达水平。qPCR结果显示,与正常大鼠相比,模型大鼠结肠组织黏膜IL-6、JAK2、STAT3mRNA表达水平均显著提高,而模型大鼠给予JFP后,IL-6 mRNA表达水平显著降低,JAK2、STAT3 mRNA只在低剂量组呈显著性差异,而在高、中剂量组没有明显差异。然而,Westernblot结果显示,与正常大鼠相比,模型大鼠结肠组织黏膜STAT3及其磷酸化蛋白p-STAT3及p-JAK2表达水平均显著提高,该蛋白与其基因表达不一致,表明IL-6/STAT3通路在蛋白翻译后对菊多糖产生响应。当肠道微生物与宿主之间的平衡被打破,革兰阴性细菌数量增加,LPS诱导的TLR4/NF-κB、IL-6/STAT3途径就被过度激活,炎症反应被放大,导致炎症性肠病发生发展。因此,维持肠道微生态平衡,抑制或阻断TLR4-NF-κB、IL-6/STAT3信号通路,将有助于控制和改善炎症性肠病病情及预防其复发。2.3基于代谢组学的思路与方法,探寻炎症性肠病大鼠病理状态下血浆、尿液代谢物组的整体变化,在筛选、鉴定其血浆和尿液中潜在的生物标志物的基础上,研究JFP干预后的代谢变化规律,挖掘JFP改善和缓解炎症性肠病的可能机制。实验结果显示,结肠炎大鼠血浆中亚油酸、花生四烯酸、牛磺脱氧胆酸、胆酸、鹅去氧胆酸等表现为下调趋势,白三烯A4、甘氨酸、二氢神经酰胺、胆固醇等表现为上调趋势。涉及代谢通路包括胆汁酸生物合成、视黄醇代谢、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢、色氨酸代谢、不饱和脂肪酸生物合成、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢、类固醇激素生物合成,其中影响较高的代谢通路有花生四烯酸代谢、胆汁酸生物合成、甘油磷脂代谢;结肠炎大鼠尿液中,烟酰胺、甘油磷酰胆碱、尿刊酸、烟酸单核苷酸、二氢尿嘧啶、磷酰胆碱等表现为下调趋势,D-葡糖醛酸-6,3-内酯、甲基咪唑乙酸、2-氧代-4-甲硫基丁酸等表现为上调趋势。涉及代谢通路包括烟碱和烟酰胺代谢、组氨酸代谢、赖氨酸降解、甘油磷脂代谢、赖氨酸生物合成、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、肌醇磷酸代谢、嘧啶和嘌呤代谢等。从代谢通路方面分析,抗坏血酸代谢、烟碱和烟酰胺代谢、甘油磷脂代谢、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢和组氨酸代谢影响值相对较高。JFP可影响上述代谢途径,对上述标志物的水平均有不同程度的回调,向正常状态转变,说明菊非药用部位多糖能改善和缓解结肠大鼠的症状。(三)基于活性导向下的菊非药用部位均一多糖的制备及结构表征1.菊非药用部位均一多糖的制备称取菊根、茎、叶部位干燥样品2 kg,石油醚脱脂两次,加热回流提取,合并两次提取液后浓缩,乙醇沉淀,得菊非药用部位粗多糖;对粗多糖中所含中性多糖、酸性多糖以及蛋白质含量进行测定,结果显示,中性多糖和酸性多糖分别为42.67±2.94%和18.36±1.09%,蛋白质含量为6.17±1.02%。由此可见,中性多糖是粗多糖中的主要组成成分。此外,采用三氯乙酸法除蛋白,大孔吸附树脂AB-8对粗多糖进行脱色、除杂,再经DEAE-52纤维素柱进行不同梯度的洗脱,最后经葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析进一步精制、纯化,经洗脱、收集、减压浓缩、透析、冷冻干燥后,获得含量及纯度相对较高的均一性多糖 JFP1-1-2(1.6%)和 JFP1-2-2(0.4%)。2.菊非药用部位均一多糖的结构表征采用傅里叶红外光谱IR、酸水解、甲基化、13C-NMR,1H-NMR核磁共振等方法,对均一多糖JFP1-1-2和JFP1-2-2的结构进行分析,结果表明,JFP1-1-2主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖以摩尔比4.53:3.06:1.00组成;JFP1-2-2主要由甘露糖、半乳糖、葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸以摩尔比3.01:2.36:1.25:1.00:1.02组成。将此两种多糖经甲基化并水解后,采用 GC/MS 分析,结果显示,JFP1-1-2 中含有T-β-D-Manp、5,6-β-Manp、1,3,5-β-D-Manp、1,3-β-D-Manp、1,5-β-D-Galp、T-β-D-Galp、2,4-β-D-Galp、1,3,5-β-D-Glcp和 2,3,4-β-D-Glcp 连接顺序的糖残基,其摩尔比为 13.41:3.39:30.30:1.87:18.01:6.22:15.10:7.01:4.69;JFP1-2-2 中含有 T-β-D-Manp、5,6-β-D-Manp、1,4-β-D-Manp、1,3,5-β-D-Manp、2,3,5-β-D-Manp、1,5-β-D-Galp、2,4-β-D-Galp、1,3,5-β-D-Glcp、T-β-D-Xylp 连接顺序的糖残基,其摩尔比为 2.31:0.44:1.12:2.6:2.86:5.87:3.33:4.56:4.80。由此可见,不论是中性多糖JFP1-1-2,还是带有酸性基团的JFP1-2-2,其糖结构中甘露糖的含量比例最大。而研究报道甘露糖受体MR可特异性地识别以甘露糖为末端的配体,介导吞噬病原微生物,发挥免疫调节作用。本实验研究表明,菊非药用部位多糖结构中含有大量的甘露糖,可能易于结合巨噬细胞和树突状细胞膜表面上的甘露糖受体,消除病原微生物,改善肠道微生态平衡,进而改善模型大鼠炎症性肠病的症状。这一假说,将在后续的实验研究中继续探讨和证实。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】