AF1q、CD44和circRNA在白血病中的作用及机制研究

发布时间：2018-01-04 03:01

本文关键词：AF1q、CD44和circRNA在白血病中的作用及机制研究　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分AF1q调控CD44在慢性髓性白血病细胞增殖及耐药中的作用及机制研究研究背景:慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,Ph染色体和BCR/ABL融合基因是CML的标记性改变。BCR/ABL蛋白具有活跃的酪氨酸激酶活性,可促使造血干细胞向髓系祖细胞分化,引发髓系细胞扩增并抑制其凋亡,最终导致CML的发生。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor,TKI)能选择性抑制BCR/ABL蛋白的酪氨酸激酶活性,可显著改善CML患者的预后,开创了靶向治疗的新时代。然而,随着临床上的广泛应用和时间的推移,TKI的耐药现象日益明显,复发率逐渐升高,严重影响了CML的治疗效果。因此,探索TKI的耐药机制,寻找新的治疗靶点,成为目前CML研究的热点之一。AF1q基因(又名MLLT11)定位于人类染色体1q21,是混合谱系白血病基因(mixed-lineage leukemia,MLL)的伙伴基因。研究显示其表达水平在急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)和急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)患者中普遍升高,且AF1q高表达在AML及骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)中是一个独立的预后不良因素。以上结果提示,AF1q可能在白血病中发挥着重要的作用。我们前期研究发现,AF1q在CML患者中表达升高,而且在CML CD34+白血病干/祖细胞中的升高水平尤为明显。然而,目前有关AF1q基因功能的报道极少,其在白血病中发挥作用的途径及机制尚不清楚。研究目的:研究AF1q在CML不同分期患者体内的表达水平;明确AF1q表达异常对CML细胞增殖及药物敏感性的影响;探讨AF1q在CML中发挥作用的机制,为逆转伊马替尼(Imatinib,IM)耐药、预防CML复发提供新的治疗靶点。研究方法:1.标本采集及细胞分选:收集149例CML患者和15例健康对照者的骨髓标本,应用淋巴细胞分离液提取骨髓中的单个核细胞。磁珠法分选13例CML初诊慢性期患者和7例健康对照者骨髓标本中的CD34+细胞。2.AF1q表达水平检测:Real-Time RT-PCR检测CML各期患者和健康对照者骨髓原代细胞及CD34+细胞中AF1q的mRNA表达水平。3.构建AF1q表达载体及合成小干扰片段:在293T细胞中包装携带有AF1q表达载体(pLOC-AF1q)和阴性对照质粒(pLOC-NC)的慢病毒;合成针对AF1q基因的siRNA和阴性对照片段NC siRNA。4.转染CML细胞系、原代细胞及CD34+细胞:应用pLOC-AF1q及pLOC-NC病毒转染K562细胞系(AF1q上调组与对照组),blasticidin筛选至少2周后获得稳定转染的细胞;应用Lipofectamine 2000将AF1q siRNA和NC siRNA转染K562/G01细胞系、CML初诊原代细胞及CD34+细胞(AF1q下调组与对照组)。Real-Time RT-PCR和Western blot分别验证AF1q的上、下调效率。5.细胞增殖、凋亡及药物敏感性检测:将转染后的细胞种于细胞培养板中,CCK8法检测细胞增殖速度;加入IM孵育48小时,CCK8法检测药物敏感性、流式细胞术检测细胞凋亡率变化。6.动物实验:NOD/SCID免疫缺陷小鼠经1.5Gy射线照射后,尾静脉注射AF1q上调组及对照组K562细胞,4周及8周后分别应用流式细胞术检测骨髓及脾脏中人源性CD33分子(K562细胞标志性表面分子)含量。7.芯片检测:应用全基因组芯片技术筛选AF1q上调组及对照组K562细胞之间差异表达的mRNA,针对芯片结果行GO及pathway分析。8.CD44表达水平检测:选取芯片结果中具有差异性表达的CD44作为AF1q下游候选分子。Real-Time RT-PCR检测CML初诊慢性期患者骨髓原代细胞及CD34+细胞中CD44的mRNA表达水平,并分析其与AF1q的相关关系。9.封闭CD44分子:在AF1q上调组K562细胞中,应用中和抗体阻断CD44的生物学作用,观察其对细胞增殖、凋亡和药物敏感性方面的影响。研究结果:1.CML患者AF1q的表达情况:与健康对照者相比,AF1q在CML各期患者中表达水平均明显增高,且慢性期(Chronic phase,CP)、加速期(accelerate phase,AP)或急变期(blast phase,BP)患者的表达水平明显高于CR患者;CR患者的表达水平则显著高于健康对照者。进一步结果显示,CML初诊患者CD34+细胞中AF1q的表达水平明显高于同源CD34-细胞,同时高于健康对照者的CD34+细胞,提示AF1q可能在CML白血病干细胞中发挥重要作用。2.AF1q表达下调对细胞凋亡及药物敏感性的影响:在CML原代细胞及CD34+细胞中下调AF1q表达后,CCK8结果显示细胞对M诱导的药物敏感性增强,流式细胞术结果表明细胞凋亡率增加。3.AF1q表达上调对细胞增殖、凋亡及药物敏感性的影响:在IM敏感细胞株K562中上调AF1q表达后,CCK8结果显示细胞增殖速度加快、对IM诱导的药物敏感性降低,流式细胞术结果表明细胞凋亡率减少。同时,在IM耐药细胞株K562/G01中下调AF1q表达后,CCK8结果显示细胞增殖速度减慢、对IM诱导的药物敏感性增强,流式细胞术结果表明细胞凋亡率增加。以上结果表明,AF1q可参与调控CML细胞的增殖、药敏与凋亡。4.AF1q表达上调对CML细胞体内定植能力的影响:尾静脉注射细胞4周及8周后,AF1q上调组小鼠脾内K562细胞含量均高于对照组小鼠;骨髓中K562细胞定植较少,4周后两组小鼠骨髓中K562细胞含量无明显差异,8周后AF1q上调组小鼠骨髓中K562细胞含量高于对照组。5.芯片结果:应用全基因组芯片技术在AF1q上调组及对照组K562细胞之间筛选出582个差异性表达基因,其中上调基因465个,下调基因117个。GO及pathway分析发现,K562过表达AF1q后生物学行为改变涉及细胞生长、机体发育、信号转导及刺激应答等方面,主要涉及凋亡相关通路、肿瘤转录异常调节、Ras、PI3K-AKT、mTOR等信号通路。在结果中选择表达差异明显、与白血病发病与耐药有密切关系的CD44作为AF1q下游候选分子。6.CML患者CD44的表达情况以及与AF1q的相关关系:在CML初诊CP期患者骨髓原代细胞及CD34+细胞中,CD44表达水平与AF1q表达均呈显著正相关;在CML细胞中上、下调AF1q表达后,CD44分子表达亦随之上、下调。此外,在CD34+细胞中,CD44的表达水平明显高于同源CD34-细胞。以上结果提示,在CML中AF1q能正向调控CD44的表达。7.AF1q通过调控CD44发挥生物学功能:在AF1q上调组K562细胞中阻断CD44分子后,CCK8结果显示细胞增殖速度减慢、对IM诱导的药物敏感性增强,流式细胞术结果表明细胞凋亡率增加。由此可见,在CML中AF1q可通过调控CD44发挥其生物学功能。结论:1.AF1q在CML各期患者中的表达水平均高于健康对照者,提示AF1q在CML的发生、发展中发挥作用。2.通过调控AF1q表达水平,可改变CML细胞的增殖速度、药物敏感性及药物诱导的细胞凋亡率,证实AF1q在CML中具有促进增殖、降低药物敏感性以及抵抗凋亡的作用。3.AF1q在CML中具体作用机制之一是通过调控CD44的表达介导,这两种分子可能为CML的治疗提供新靶点。第二部分circRNA在急性髓性白血病中的表达谱及生物信息学分析研究背景:急性髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类异质性很强的造血系统恶性疾患,常常伴随多种遗传学及基因学异常。AML的治疗主要以化疗为主,但治疗过程中出现的耐药、复发以及毒副作用,使病死率一直维持在较高的水平。随着分子遗传学技术的发展,AML的各类生物学指标逐渐被熟知,其中细胞遗传学及分子学指标尤为突出,成为辅助诊断、指导治疗及预后分层的有力工具。近年来,围绕DNA突变、microRNA及IncRNA等方向的大量研究正广泛开展,致力于发现更多的AML生物学指标,提高对白血病特点的认识,以助于监测微小残留病变、提高预警能力和开发新型靶向治疗药物。环状RNA(Circular RNAs,circRNAs)是一类广泛存在的非编码RNA,以往的相关报道较为少见。circRNA具有闭合的环状结构,不易被降解,因而比同源线性RNA更为稳定。在早期的研究中,circRNA被认为形成于外显子转录本的错误剪接,作为随机产物并不具备生物学功能,然而随着生物信息学及高通量测序技术的迅速发展,大量circRNA被发现并引起关注。越来越多的证据表明,circRNA并非偶然产生,其丰度高、结构稳定并存在时空表达特异性,很可能在调控生物体基因表达过程中发挥重要作用。另有少量研究报道,circRNA可能在肿瘤的发生发展过程中发挥着某种作用,然而其在AML疾病进程中的表达及功能尚不清楚。研究目的:研究AML中circRNA的表达谱,筛选出与AML危险度分层相关的特异性circRNA;寻找circRNA表达谱中潜在的AML诊断指标和治疗靶点,并对其进行特征鉴定和功能分析。研究方法:1.标本采集:收集113例AML患者和12例健康对照者的骨髓标本,应用淋巴细胞分离液提取标本中的单个核细胞。10例标本用于circRNA芯片检测,115例标本用于后续研究。2.芯片检测:提取10例标本(6例AML,4例健康对照)的总RNA并用RNA酶处理,除去线性RNA后转录为荧光素标记的互补RNA,继而用于芯片杂交。扫描并分析孵育后的杂交芯片,获得标准化的circRNA表达数据。3.Real-Time RT-PCR验证表达水平:提取115例标本的总RNA并转录为cDNA,应用Real-Time RT-PCR检测并获取相关基因的Ct值,GAPDH作为内参用于数据分析。4.miRNA预测及功能分析:应用Arraystar软件预测circRNA-miRNA的相互作用;应用 Cytoscape 描绘 circRNA-miRNA-mRNA/gene interaction 网络图;应用GO及KEGG分析预测靶基因的相关功能及通路。研究结果:1.AML患者中的circRNA表达谱:在芯片13617个circRNA的检测范围内,4573个circRNA可被检测到信号,其中464个circRNA在AML中差异性表达,上调147个,下调317个。与健康对照者相比,AML患者中12个circRNA的差异表达倍数高达10倍以上。2.AML危险度分层相关的特异性circRNA:2.1进一步研究低危及高危组AML患者结果发现,2个上调circRNA(hsa_circ_0035381,hsa_circ_0049657)和 3 个下调 circRNA(hsa_circ_0001187,hsa_circ_0008078,hsa_circ_0001947)的表达与 AML 危险度分层相关。2.2 circRNA可作为miRNA海绵竞争性调控miRNA的生物活性。GO及KEGG分析以上5个circRNA相关的miRNA及其靶基因,结果显示此类AML危险度分层特异性circRNA可参与调节多种生物学过程及信号通路。3.hsa_circ_0004277 在 AML 中的表达情况:3.1在AML特异性circRNA表达谱中,选取表达水平较高、下调倍数明显的hsa_circ_0004277作为研究对象,探索其在AML中的表达情况。与健康对照者相比,hsa_circ_0004277在初诊未治AML患者中表达水平明显降低;患者经治疗达到CR后,hsa_circ_0004277表达得以恢复,与健康对照者无差异;当CR患者病情复发,hsa_circ_0004277表达水平再次降低,与初诊未治阶段相似。3.2 ROC曲线分析结果显示,hsa_circ_0004277的曲线下面积为0.957,作为AML预后指标具有较高潜力。3.3 hsa_circ_0004277同源线性RNA WDR37在初诊未治AML患者中表达水平较健康对照组明显降低,在CR组患者中表达得以恢复,与hsa_circ_0004277情况类似。相关性分析结果显示,AML患者中hsa_circ_0004277和WDR37的表达水平呈显著正相关。4.化疗对AML患者hsa_circ_0004277表达水平的影响:在AML患者初诊未治阶段及CR阶段监测hsa_circ_0004277的表达变化,针对每一患者两阶段结果配对分析发现,化疗成功后,hsa_circ_0004277表达水平得以显著提升。5.hsa_circ_0004277的靶向miRNA预测及生物信息学分析:circRNA-miRNA-mRNA/gene interaction 网络图显示,预测结果中hsa-miR-138-5p及hsa-miR-30c-1-3p具有较为复杂的相互作用网络,hsa-miR-892b,hsa-miR-571,and hsa-miR-328-3p 靶基因则相对较少。其中,SH3GL2,PPARGC1A,PIP4K2C,SH2B3,ZNF275 及 ATP1B4 六个靶基因受到2个miRNA调控。结论:1.circRNA芯片结果展示了 AML患者中的circRNA表达谱,从中筛选出了 5个与AML危险度分层相关的特异性circRNA;2.hsa_circ_0004277在AML中具有特异性表达,可作为潜在的AML诊断指标和治疗靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.7

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