Hsp90功能执行的动力学分子机制研究及其变构抑制剂发现

发布时间：2018-01-04 06:09

本文关键词：Hsp90功能执行的动力学分子机制研究及其变构抑制剂发现　出处：《中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：Hsp90是分子伴侣蛋白家族的重要成员。它能够辅助完成客户蛋白质的结构活化或组装,维持细胞中蛋白质生成与降解的平衡。目前已经明确的Hsp90客户蛋白达到了~300种,其中包括激素受体、转录因子、细胞周期调控蛋白和激酶等。Hsp90的客户蛋白质名单中包括了一些著名的癌蛋白,通过调控与癌症发生相关的客户蛋白质的动态平衡,Hsp90可在多个途径、多个环节影响肿瘤的发生和发展进程,Hsp90是抗肿瘤药物研发的热门靶点。Hsp90主要由三个功能结构域构成:N端ATP结合结构域、客户蛋白质识别结构域(中间结构域)和C端二聚化结构域,而其功能执行过程则同时受到内源性小分子(ATP、ADP)和内源性生物大分子(共伴侣蛋白p23、Cdc37、Aha1等)的精细调控。Hsp90具有ATP水解酶活性,ATP的结合与水解引发Hsp90 N端结构域和中间结构域发生一系列构象变化并最终完成对客户蛋白质的活化或组装。ATP结合和水解所引发的Hsp90的构象变化对于Hsp90整个功能执行过程的完成至关重要,然而截至目前为止,我们对于这一过程的了解尚未明晰。鉴于ATP水解酶活性对Hsp90功能执行的重要性,ATP结合竞争抑制剂是目前以Hsp90为靶点的抗肿瘤药物研发的主攻方向。截至2015年,已有17个靶向Hsp90 N端ATP结合/催化口袋的抑制剂进入临床实验阶段,然而迄今为止,尚未有相关药物成功获批上市,化合物的毒副作用是导致这种结果的最重要原因。开发靶向Hsp90中间结构域的变构抑制剂有望实现在抑制肿瘤进程的同时规避相关毒副作用的产生。基于Hsp90的上述研究现状,在本论文工作中,我们主要利用NMR实验技术对ATP依赖的Hsp90的构象变化过程进行探讨,尝试在原子水平阐明Hsp90功能执行的动力学分子机制。此外,在结构生物学的研究基础上使用基于片段的活性化合物发现技术尝试获得靶向Hsp90中间结构域的变构抑制剂,并在分子水平解析这些新型抑制剂的效应机制及其结构基础,这些抑制剂有可能发展为毒副作用较小的抗肿瘤药物。为了阐明ATP依赖的Hsp90 N端结构域构象变化的动力学分子机制,在本论文的第一部分工作中,我们开展了基于核磁共振技术的自由态Hsp90 N端结构域及其与amppcp(atp类似物)和adp所形成复合物的动力学行为研究。[1h,15n]hsqc滴定实验、动力学实验和核磁信号线形分析实验数据显示:amppcp和adp二者与hsp90的结合模式整体上相类似,然而,它们的结合对介导hsp90n端结构域二聚化的lid片段及其附近区域(l107-a141:其中lid区域为a111-g135)的影响具有显著差异:amppcp的结合增强了hsp90lid区域在?s-ms时间尺度上的慢构象交换运动,而adp的结合使得lid区域变得更为刚性,与nmr动力学实验数据相一致,itc实验数据显示hsp90n端结构域和adp的结合过程伴随熵值减小。依据核磁共振动力学和itc实验结果,我们提出了atp/adp依赖的hsp90n端结构域构象转化的动力学工作模型:在静息状态下,hsp90n端结构域中的lid片段以包括高能“关闭”构象在内的多种构象状态存在,atp的结合将通过提高lid区域在?s-ms时间尺度上活动性而增加高能“关闭”构象的占比,在hsp90中间结构域和其它辅因子的进一步帮助下,hsp90n端结构域发生二聚化,在二聚体中,lid片段区域以“关闭”构象状态存在。在atp水解为adp分子后,hsp90n端结构域的lid片段区域活动性显著下降,在溶液中主要以惰性构象存在。在随后的工作中,我们使用hsp90αnmΔ样品开展了[1h,15n]hsqc滴定实验,考察了中间结构域对hsp90n端结构域adp/atp(amppcp)识别结合过程的影响,结果显示,adp/amppcp与hsp90αnmΔn端结构域和中间结构域的作用模式与adp/amppcp和单独存在时的n端结构域及中间结构域的作用模式一致。在使用hsp90αnmΔ样品的情况下,由adp/amppcp结合所引发的hsp90构象变化主要集中在其n端结构域。在本论文的第二部分工作中,我们开展了靶向hsp90中间结构域的基于核磁共振技术的阳性化合物筛选,获得了阳性化合物1个(1-e6),随后,我们使用基于[1h,15n]hsqc滴定实验的化学扰动分析方法完成了对hsp90中间结构域:1-e6复合物结构的初步表征,并在此基础上进一步完成了对1-e6的初步结构优化,获得了与hsp90中间结构域的结合强度(结合解离常数kd)在百?m水平的活性化合物两个:16-171和16-175。在后续工作中,我们使用核磁共振技术对两个活性化合物的分子水平效用机制进行了研究,研究结果显示,这两个活性化合物对Hsp90的功能执行具有变构调节效应,它们与中间结构域的结合导致Hsp90 N端结构域的构象发生改变,由中间结构域诱导产生的另一种Hsp90 N端结构域稳定构象近于完全消失,而16-171和16-175的这种变构调节效应不受激活型共伴侣因子Aha1存在与否的影响,但是当另一抑制型共伴侣因子P23存在时,它们施加于Hsp90的变构调节效应消失。此外,细胞水平的肿瘤细胞增殖抑制实验显示:16-171和16-175具有十?M~百?M水平的人乳腺癌SKBR3细胞生长抑制活性。
[Abstract]:Hsp90 is an important target for the development of Hsp90 . At present , there have been a series of conformational changes in Hsp90 , including hormone receptors , transcription factors , cell cycle regulatory proteins and kinases . In the second part of this thesis , we investigated the effect of the binding process on the domain of the Hsp90n terminal domain . The results showed that the binding process of the two domains of the Hsp90n - terminal domain was significantly different from the experimental data . In the second part of this thesis , we carried out the screening of the positive compounds based on the nuclear magnetic resonance technology of the middle domain of the Hsp90 . However , when another inhibitory copartner factor P23 is present , they are applied to the altered regulatory effect of Hsp90 . In addition , tumor cell proliferation inhibition experiments at cell levels show that 16 - 171 and 16 - 175 have 10 ? M to 100 ? M levels of human breast cancer SKBR3 cell growth inhibitory activity .

【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R91

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