FAM83D上调CD44表达促进肝细胞肝癌干性及转移能力的机制研究

发布时间：2018-01-05 18:21

本文关键词：FAM83D上调CD44表达促进肝细胞肝癌干性及转移能力的机制研究　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:原发性肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种常见的高致死率恶性肿瘤,也是我国最主要的公共健康问题之一。虽然目前在针对HCC的早期筛查、诊断、手术技术等方面取得了明显进步,并显著延长了 HCC患者的生存时间和改善了生存质量,但是HCC的高转移率和术后高复发率始终限制着总体生存率的提高。如何有效防治术后复发转移已经成为进一步改善HCC患者生存预后的关键问题。基因组突变和重组是HCC获得更强异质性以及包含干细胞特性、高度耐药性等恶性能力的原始动力,在增强HCC细胞生存能力中起重要作用。全面解读HCC肿瘤基因组发生的突变、结构异常、染色体重构以及拷贝数变异等信息可为揭示HCC复发转移分子机制的研究提供重要线索,并促进早诊分子标记物与精准治疗靶标的发现。目的:本研究旨在借助高通量RNA测序技术对HCC组织和相应的癌旁组织进行转录组的解读,寻找与HCC发生发展密切相关的关键癌基因。扩大样本重点验证候选癌基因FAM83D在HCC患者中的表达模式以及临床意义。体外构建FAM83D敲减细胞株,明确FAM83D在维持HCC细胞干性中的作用。最后,借助基因芯片和蛋白质谱实验阐明FAM83D调控HCC复发转移的潜在分子机制。材料与方法:1.通过高通量RNA测序和生物信息学分析筛选HCC组织与相应癌旁组织间的差异表达基因。2.收集150对HCC患者肿瘤组织、配对癌旁组织以及临床病理信息,利用免疫组织化学、实时荧光定量PCR等方法验证候选基因FAM83D在HCC组织及癌旁组织中的表达模式,分析FAM83D在HCC组织中的表达水平与患者肿瘤病理参数、生存预后之间的相关性。3.通过体外转染FAM83D-siRNA慢病毒构建FAM83D敲减HCC细胞株,借助悬浮球细胞培养实验、流式细胞仪表面蛋白表达量分析实验、Western免疫印迹实验检测FAM83D对HCC细胞干性能力、肿瘤干细胞标志物表达、肿瘤干细胞扩增的影响;利用裸鼠体内成瘤实验和细胞侵袭实验观察FAM83D对HCC细胞成瘤、转移能力的影响。4.降低HCC细胞株FAM83D表达后,利用转录组基因芯片实验进行差异表达基因的筛选,通过GO和KEGG分析初步探索FAM83D参与HCC细胞干性调控的潜在分子机制。5.通过信号通路小分子抑制剂抑制实验和CD44-siRNA转染实验验证CD44与MAPK、TGF-β以及Hippo通路之间的相互调节关系,利用蛋白免疫共沉淀实验和质谱分析明确FAM83D调控上述信号通路的关键上游分子。结果:1.通过对10对HCC样本患者的高通量RNA测序,共筛选得到HCC组织及癌旁组织间差异表达基因544个(倍数改变2,P0.01),其中321个过表达基因,223个为低表达基因。FAM83D在9对HCC样本中表达水平显著增高,平均表达增高倍数超过8倍。2.在扩大验证的150对HCC样本中,qRT-PCR和免疫组织化学实验结果证实FAM83D在HCC组织中的表达水平显著高于配对癌旁组织(P0.01)。高表达FAM83D与HCC患者恶性肿瘤生物学特征正相关,如肿瘤低分化、血清高AFP水平、门静脉侵犯、肿瘤数目3等。与FAM83D低表达组相比,FAM83D高表达患者拥有更高的肝移植术后肿瘤复发率和更短的无瘤生存时间。3.体外细胞干性实验证实HCC细胞株敲减FAM83D后,显著抑制了 CD44s和CD44v分子的表达以及悬浮球形成能力。体内动物实验发现下调FAM83D后可显著抑制HCC细胞株的成瘤能力、肿瘤转移能力以及肺克隆能力。4.转录组基因芯片结果提示FAM83D下调后可引起1565个基因出现差异表达(倍数2,P0.01),主要分布于MAPK、TGF-β以及Hippo等信号通路。敲减FAM83D表达后,ERK1/2、Smad2磷酸化水平下降,YAP表达水平受到抑制,YAP磷酸化水平相对增高。5.MAPK、TGF-β以及Hippo信号通路抑制后,可显著下调CD44分子的表达;干扰CD44表达后,ERK1/2、Smad2磷酸化、YAP表达水平下降,YAP磷酸化水平相对增高,提示CD44与上述信号通路存在互相调节作用。6,6.蛋白免疫共沉淀实验和质谱分析,发现RAP1为FAM83D调控MAPK、TGF-β以及Hippo信号通路的关键上游分子。结论:1.相对于癌旁组织,FAM83D在HCC组织的表达水平明显升高,并与恶性肿瘤生物学行为和不良预后相关。2.敲减FAM83D可显著抑制CD44分子的表达和HCC细胞株的干性、成瘤、转移能力,提示FAM83D可能为HCC精准治疗的新靶标。3.MAPK、TGF-β以及Hippo信号通路是FAM83D参与调控CD44分子表达和HCC发生发展的潜在分子机制。
[Abstract]:BACKGROUND : Primary hepatocellular carcinoma ( HCC ) is one of the most common malignant tumors in HCC and is one of the most important public health problems in HCC . Conclusion : 1 . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo in HCC cell line decreased and the expression level of YAP decreased . The expression level of MAPK , TGF - 尾 and Hippo signal pathway were significantly inhibited .

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

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