包裹溶瘤腺病毒的微颗粒和6氨基烟酰胺在肿瘤治疗中的作用

发布时间：2018-01-06 00:16

  本文关键词：包裹溶瘤腺病毒的微颗粒和6氨基烟酰胺在肿瘤治疗中的作用　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的:溶瘤腺病毒(OA)是一种经过基因改造的病毒,直径在80-100nm左右,是目前肿瘤生物疗法的手段之一。病毒本身的免疫原性、肿瘤细胞下调受体表达等会导致溶瘤腺病毒杀伤肿瘤能力下降,这限制了它在临床上的广泛运用。微颗粒是外界刺激比如紫外,高温等导致的细胞凋亡过程中产生的囊泡结构。在外部刺激下,细胞骨架发生改变,使得细胞质中的组分被细胞膜包裹,形成直径约100-1OOOnm的囊泡。这些囊泡分泌到细胞外,就成为微颗粒(MP)。已有研究发现,肿瘤细胞来源的微颗粒不仅可以作为疫苗用于预防和治疗肿瘤,也可以作为纳米材料包裹化疗药物对肿瘤进行杀伤。本部分工作尝试探讨微颗粒包裹溶瘤腺病毒(OA-MPs)的可行性及其存在的优势,并对微颗粒进入肿瘤细胞的机制进行了初步探索。方法:(1)为研究MP是否能包裹OA,我们借助透射电子显微镜观察OA-MP中OA与MP的相对位置关系。为明确单个MP中包裹OA的数量,提取OA-MPs和OA的全基因组DNA后用实时定量PCR方法分析。(2)为检测OA-MPs是否具有生物学活性,我们分别将MPs、OA-MPs、OA与A549细胞中共孵育,借助Western Blot检测细胞内OA相关蛋白Hexon、Fiber和E1A的表达情况。(3)为比较OA-MPs、OA、MPs的肿瘤杀伤能力,将三者分别与A549肿瘤细胞共孵育,48小时后用显微镜观测A549肿瘤细胞的形态。为研究不同细胞来源的MP所包裹的OA对肿瘤细胞的影响,利用三种不同细胞(A549、HEK293、K562)来源的MP来包裹病毒,然后将所得的OA-MPs与A549肿瘤细胞共孵育,并用流式细胞仪来分析肿瘤细胞的凋亡率。(4)为研究OA-MPs对小鼠肝肾功能的影响,我们将PBS、MPs、OA、OA-MPs分别注射于小鼠腹腔,连续注射五日后,借助试剂盒分析小鼠眼球血中ALT和CRE的含量。为研究OA-MPs对正常细胞的影响,将PKH26标记的OA-MPs与正常志愿者血液中的外周血单个核细胞(PBMC)共孵育,分别于6h、12h、24h三个时间点用流式细胞仪测定PBMC中PKH26的荧光表达。将OA-MPs、OA、MPs分别与PBMC共孵育12小时,用流式细胞仪来检测PBMC的凋亡率。(5)为研究OA-MPs在肿瘤细胞内的复制情况,将OA-MPs和OA分别与A549细胞共同培养,于不同时间点利用实时定量PCR技术测定胞内病毒的滴度。为研究OA-MPs在肿瘤组织的药效动力学特征,将OA-MPs注射于裸鼠的肿瘤部位,于6h、12h、24h、36h、72h、96h时间点取出肿瘤,用实时定量PCR技术分析肿瘤内部病毒DNA的滴度。(6)用流式分析不同干扰因素(肝素、温度、MP尺寸、EDTA、胰蛋白酶、pH)对肿瘤细胞吞噬微颗粒效率的影响。(7)用激光共聚焦显微镜观察微颗粒膜与肿瘤细胞膜之间相对位置关系。(8)借助分子动力学模拟探讨微颗粒进入细胞的机制。结果:(1)在电镜下面直接观测到MP中包裹的OA。实时定量PCR的结果显示每MP携带约5个OA。(2)OA-MPs和OA 一样,均可在A549细胞内表达Hexon、Fiber和E1A三种蛋白,但MP组和control组未见这三种蛋白的表达。(3)A549细胞与OA-MPs共孵育后,细胞处于半悬浮的状态,变圆,状态最差;与OA共孵育后,细胞贴壁,状态欠佳;而对照组以及MP组中,细胞状态良好。流式结果显示不同细胞A549、HEK293、K562产生的OA-MPs使肿瘤细胞发生凋亡率分别为31%、29%、22%。(4)MPs、OA、OA-MPs各组小鼠血液中的ALT与PBS对照组相近,约为13U/L;CRE也与PBS对照组相近,约为18 umol/L。PBMC与OA-MPs共孵育 6h、12h、24h 后分别吞噬 50%、59%、63%的 OA-MPs。PBMC 与 OA-MPs、OA、MPs、PBS分别共孵育12h后PBMC的凋亡率分别为18.3%、21.4%、24.3%、19.2%,说明OA-MPs对正常的PBMC细胞无任何影响。(5)OA-MPs和OA分别与A549细胞共同培养,实时定量PCR分析显示不同时间点OA-MPs组的A549细胞内病毒滴度都明显高于OA组。OA-MPs注射于裸鼠肿瘤部位,实时定量PCR分析显示肿瘤内部OA在注射36小时病毒载量达到最高值。(6)4℃共孵育2h和4h,肿瘤细胞摄取微颗粒分别为20.2%和28.1%;37℃共孵育2h和4h,肿瘤细胞摄取微颗粒分别为87.6%和92.3%。PBS处理的肿瘤细胞与胰蛋白酶处理的肿瘤细胞对微颗粒的摄取在2h时分别为85.6%和18.1%;在4h时,分别为94.8%和28.4%。在OuM、100uM、500uM、1000uM EDTA浓度下,肿瘤细胞摄取微颗粒的效率分别为88.4%、83.7%、47.2%、40.4%。pH 值为 6.4、6.8、7.2、7.5、8.0、8.5、9.0 时,肿瘤细胞摄取微颗粒分别为 76.4%、76.2%、71.5%、64.8%、65.4%、14.8%、5.93%。微颗粒尺寸在100-220nm,220nm-600nm,600-1000nm三个不同范围内,肿瘤细胞摄取微颗粒分别为63.1%、21.6%和14.2%。当加入肝素的浓度为0ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、50ug/ml、100ug/ml时,肿瘤细胞摄取微颗粒分别为95%、37.2%、36.1%、35%和32.5%。(7)肿瘤细胞膜用PKH26标记为红色,微颗粒用PKH67标记为绿色,共孵育20min后,激光共聚焦显示微颗粒的绿色荧光出现于肿瘤细胞膜处和肿瘤细胞内部。肿瘤细胞膜不作标记,微颗粒用PKH67标记为绿色,激光共聚焦显示6h后多数微颗粒所携带的绿色进入细胞内部,少数微颗粒所携带的绿色标记于肿瘤细胞膜。当把PKH67标记的绿色微颗粒,红色标记的葡聚糖以及肿瘤细胞三者共孵育,激光共聚焦结果显示微颗粒的绿色荧光分布于肿瘤细胞表面或内部,葡聚糖的红色荧光分布于肿瘤细胞内部,两者无重合现象。(8)分子模拟结果显示,含有脂筏结构的囊泡可以在1.0μs内与细胞完成融合。且随着细胞或者微颗粒尺寸的增加,融合过程的发生愈加困难。当细胞的尺寸增大至接近水平面时(曲率较小),微颗粒可能通过穿孔过程直接进入细胞内部。结论:微颗粒能包裹溶瘤腺病毒形成OA-MPs。这种新型合成的OA-MPs较传统的裸露OA病毒存在着以下的优势:一,OA-MPs具有更强的肿瘤杀伤能力,且对正常的细胞无任何毒副作用。二,OA-MPs中的病毒可以在肿瘤细胞内更高效地进行复制。三,OA-MPs可能通过融合或穿孔过程将OA释放至肿瘤细胞内部,不依赖细胞表面的CAR受体。OA-MPs的上述研究结果显示OA-MPs在肿瘤的治疗中能发挥较好的抗癌效果,具有潜在的临床运用价值。目的:6氨基烟酰胺(6-Aminonicotinamide,6AN)被代谢为6-氨基-NAD(P +)后能竞争性抑制磷酸戊糖途径中6磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,导致细胞内活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的升高。6AN能增加肿瘤细胞对放化疗敏感性,可作为放化疗的辅助用药运用于肿瘤的治疗中。近年来,肿瘤的免疫治疗一直是研究的热点,肿瘤相关的巨噬细胞(Tumor-associated macrophage,TAM)更是受到学者们的广泛关注。研究表明,ROS作为信号分子,对巨噬细胞的表型起着重要的调节作用。本文主要探讨6AN介导的ROS升高活化巨噬细胞的可行性,并尝试阐述所涉及的信号通路,以说明6AN在肿瘤治疗中的作用。方法:(1)为研究6AN是否能活化巨噬细胞,6AN处理M0型巨噬细胞,PBS处理为对照组,借助倒置显微镜观察细胞形态的改变,用流式分析细胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和细胞内因子IL-12、IFN-γ的表达情况。为研究6AN是否活化肿瘤微环境中的巨噬细胞,用6AN连续七天腹腔注射治疗小鼠体内的肿瘤,并于第八天从腹腔分离出肿瘤相关的巨噬细胞(TAM),流式分析TAM的细胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和细胞内因子IL-12、IFN-γ的表达情况。(2)为研究6AN活化巨噬细胞的机制,6AN处理巨噬细胞,借助酶标仪分析细胞内GSH/GSSG的含量,用流式分析细胞内ROS水平的变化,用Western Blot检测AKT/MAPK通路信号蛋白的磷酸化水平,用免疫荧光技术分析转录因子NF-κB是否入核。清除小鼠体内巨噬细胞后进一步验证6AN的肿瘤治疗作用与巨噬细胞的关系。(3)为研究6AN对肿瘤干细胞的影响,在体外,我们用6AN处理3D环境中培养出的肿瘤干性样细胞(TRC),并分析TRC细胞的克隆数目、面积的变化。在体内,用6AN治疗腹水小鼠,分离出腹腔的H22细胞,并将H22培养在3D中,观察H22细胞克隆数目、面积改变。(4)为研究6AN对肿瘤杀伤的普适性,用6AN治疗不同的肿瘤小鼠如H22肝癌,CMT93结肠癌,B16F1黑色素瘤,观察小鼠生存期,测量肿瘤的大小。(5)为研究在小鼠体内6AN对顺铂的增敏作用,将6AN和顺铂联合运用治疗不同小鼠肿瘤模型(H22肝癌模型,CMT93结肠癌模型,B16F1黑色素瘤模型),观察小鼠生存期,测量肿瘤大小。结果:(1)体外,6AN处理M0型巨噬细胞,巨噬细胞由菱形扁平状变为长梭状,两边伸出明显的枝角。PBS处理组和6AN处理组的巨噬细胞表面分子CD80的表达率分别为48.8%和91.1%;CD86的表达率分别为16.1%和56.1%;MHCⅡ的表达率分别为36.7%和71.5%。PBS处理组和6AN处理组的巨噬细胞胞内因子IFN-γ的表达率分别为1.17%和5.01%;IL-12的表达率分别为0.93%和3.02%。体内,6AN治疗肿瘤小鼠八天后,结果显示对照组和6AN处理组的腹腔肿瘤相关的巨噬细胞表面分子CD80的表达率分别为11.5%和23.1%;CD86的表达率分别为5.96%和32.0%;MHCⅡ的表达率分别为4.56%和10.2%。对照组和6AN处理组的腹腔肿瘤相关巨噬细胞胞内因子IFN-y的表达率分别为70.6%和85.2%;IL-12的表达率分别为9.08%和35.4%(2)6AN处理M0巨噬细胞,细胞胞内GSH/GSSG的水平仅仅是对照组的三分之一,ROS水平约是对照组的五倍。Western Blot分析显示6AN能够在30min、1h、2h、6h、8h时间点上调AKT蛋白和ERK蛋白的磷酸化水平,其中尤以30min时刻最为显著。JNK蛋白的磷酸化水平在30min和1h时刻上调,P38的蛋白磷酸化水平在30min时刻上调。激光共聚焦结果显示6AN处理后NF-κB所携带的红色荧光与细胞核所带的蓝色荧光重合,而对照组的细胞核内未见任何红色荧光。6AN治疗的小鼠肿瘤体积、重量比PBS或者清除巨噬细胞后用6AN治疗组的低。(3)在体外,PBS处理组的TRC细胞克隆面积约为6AN处理组的三倍,克隆数目约为6AN处理组的两倍。在体内,PBS处理组的TRC细胞克隆面积和克隆数目均约为6AN处理组的两倍。(4)6AN对不同肿瘤模型小鼠均有较好的治疗效果。经6AN治疗后,肝癌小鼠和结肠癌小鼠的生存期明显延长,皮肤癌小鼠的肿瘤体积明显减小,瘤重减轻。(5)6AN-顺铂联合治疗组肺部黑色素瘤数量少于顺铂治疗组;6AN-顺铂联合治疗组的肝癌患鼠和结肠癌患鼠生存时间长于顺铂治疗组。结论:6AN能够通过ROS/AKT/MAPK/NF-κB信号通路使巨噬细胞表面分子CD80、CD86、MHCⅡ和细胞内因子IL-12、IFN-γ表达上调,从而活化巨噬细胞,诱导巨噬细胞朝向M1方向分化,最终介导肿瘤的免疫治疗。6AN也能抑制肿瘤干性细胞的生长和增强肿瘤细胞对顺铂治疗的敏感性。上述研究表明6AN在肿瘤的治疗中除了可以作为顺铂增敏剂和肿瘤干细胞抑制剂,也可以作为人体免疫系统的调控药物,具有潜在的临床运用价值。
[Abstract]:Objective: oncolytic adenovirus (OA) is a genetically engineered virus, about 80-100nm in diameter, is one of the tumor biological therapy method at present. The immunogenicity of the virus itself, tumor cells can lead to down-regulation of receptor expression of oncolytic adenovirus tumor killing ability decreased, which limits its wide application in clinic.. micro particles is outside stimuli such as ultraviolet, process of cell apoptosis caused by high temperature in the vesicle structure. Under external stimuli, cytoskeleton changes, the cytoplasmic components in the cell membrane is wrapped, forming a diameter of about 100-1OOOnm vesicles. These vesicles secreted outside the cells to become micro the particles (MP). It has been found that micro particles from tumor cells not only can be used as a vaccine for the prevention and treatment of tumors, but also can be used as a nano material coated chemotherapy drugs on tumor cells. This part of work to try To investigate the micro particles of oncolytic adenovirus (OA-MPs) and the feasibility and advantage exists, explored the mechanism into tumor cells of micro granules. Methods: (1) to investigate whether MP can package OA, we use transmission electron microscope observation of OA and MP OA-MP in the relative position. As the number of clear a single MP package OA, real time quantitative PCR analysis method for genomic DNA extraction of OA-MPs and OA. (2) to detect whether OA-MPs has biological activity, we were MPs, OA-MPs, OA and A549 cells were incubated with the Western, Blot detection of intracellular OA related protein expression of Fiber and Hexon. E1A. (3) as compared to OA-MPs, OA, MPs tumor killing ability, three were with A549 tumor cells were incubated for 48 hours, after A549 with microscope observation the morphology of tumor cells. To study the effect of different cell derived MP wrapped by OA on tumor cells 鑳炵殑褰卞搷,鍒╃敤涓夌�嶄笉鍚岀粏鑳�(A549,HEK293,K562)鏉ユ簮鐨凪P鏉ュ寘瑁圭梾姣，

本文编号：1385475