Fbxw7通过泛素化蛋白酶解YAP诱导肝癌细胞凋亡和生长停滞

发布时间：2018-01-08 10:08

  本文关键词：Fbxw7通过泛素化蛋白酶解YAP诱导肝癌细胞凋亡和生长停滞　出处：《西安交通大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 肝细胞癌 Fbxw7 Hippo-YAP信号通路 泛素化 增殖 凋亡

【摘要】：背景:原发性肝癌(Primary liver cancer,PLC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,病死率在各种癌症病死率中居第2位,其中肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)占PLC的90%以上。HCC发病率逐年升高,随着高危人群筛查、肝移植技术的成熟、影像学早期诊断以及经动脉化疗栓塞(Transcatheter arterial chemoembolization,TACE)、射频消融(Radiofrequency ablation,RFA)和索拉菲尼(Sorafenib)等辅助治疗的临床应用,HCC患者的预后较前已经有了明显的改善,但总体上还未取得令人满意的疗效。分子靶向药物索拉菲尼的临床应用弥补了晚期HCC患者治疗手段的空缺,因此,进一步明确HCC发生发展涉及的精确分子机制,探索HCC早期诊断分子标志物、设计有效的肿瘤治疗分子靶点以及患者预后指示标志物,对提高我国肝癌的治疗水平和改善肿瘤患者预后具有重要意义。泛素介导的蛋白质降解通路是基因和蛋白质功能的主要调节者和终结者,控制着真核细胞内绝大多数蛋白质的降解,因此,对该通路的调控已成为疾病治疗中的一种创新性方法。F 框/WD-40 域蛋白 7(F-box and WD repeat domain-containing 7,Fbxw7)是SCF(Skpl-Cullinl-F-box)类泛素连接酶E3复合体中特异性识别底物的关键因子,能够靶向泛素化降解 CyclinE,c-Myc,c-Jun,Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和 Notch等癌蛋白,从而抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡并增加化疗敏感性。研究表明Fbxw7在多种恶性肿瘤中表达缺失,其低表达与患者不良预后密切相关,是一种广泛的抑癌基因。p53在转录水平调节Fbxw7基因表达,p53-/+Fbxw7-/+基因敲除小鼠和受辐射的Fbxw7-/+小鼠均自发产生包括HCC在内的多种肿瘤,提示Fbxw7与HCC的发生发展存在着某种联系。Fbxw7的多个靶蛋白如CyclinE,c-Myc,c-Jun和Notch等在HCC中存在表达异常,且与HCC增殖、凋亡、耐药及不良预后密切相关。Hippo信号通路在哺乳动物中是一个高度保守有效的细胞生长和凋亡调控因子,在许多人类肿瘤特别是HCC中存在该通路的异常,而该通路的核心效应分子是Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鉴定为位于11q22扩增子的一个促癌基因,YAP转基因小鼠出现肝脏体积明显增大并最终产生肿瘤,临床研究发现YAP是一个与HCC患者无病生存期和总生存期相关的独立预测因素,提示Hippo-YAP信号通路在HCC发生发展中发挥着极其重要的作用。有研究使用液相色谱-质谱/质谱联用(Liquid chromatograph-mass spectrometer/mass spectrometer,LC-MS/MS)技术分析有丝分裂相关蛋白磷酸化位点,YAP蛋白共鉴定出17条磷酸肽和16个磷酸化位点,其中S131和T141位点[(L)-V-pS-P-(P)-G-pT]包含Fbxw7结合的保守 CDC4 磷酸决定子(CDC4 phospho-degron,CPD)序列[(L)-X-pT/pS-P-(P)-X-pS/pT/E/D],提示YAP可能是Fbxw7潜在的靶蛋白。Fbxw7在HCC中是否表达异常?是否与HCC临床病理特征相关?其表达变化是否影响HCC的增殖及凋亡?确切的分子机制是否涉及Hippo-YAP信号通路?目前尚不清楚。目的:本实验旨在探讨Fbxw7在HCC的表达及其对HCC细胞增殖和凋亡的影响,研究Fbxw7在HCC发生发展中的作用,并初步探讨其可能的分子机制,为寻找HCC新的治疗靶点奠定基础。方法:1.应用免疫组化染色、Western blot和qRT-PCR检测Fbxw7在HCC及对应癌旁组织中的表达,分析Fbxw7与HCC临床病理特征的相关性。2.应用qRT-PCR鉴定Fbxw7 mRNA在永生化人肝细胞系L02和HCC细胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402 及 Huh7 的表达水平。3.应用逆转录病毒介导的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分别转染HepG2和Hep3B细胞,qRT-PCR和Western blot检测Fbxw7表达变化,流式细胞术、Caspase3/7活性分析、BrdU细胞增殖分析和MTT法检测细胞增殖和凋亡变化。4.应用免疫组化染色检测YAP在HCC及对应癌旁组织中的表达,分析YAP与Fbxw7蛋白蛋白表达相关性。5.应用 Flag-Fbxw7 和 Fbxw7 shRNA 分别转染 HepG2 和 Hep3B 细胞,qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测YAP表达变化。6.HEK293细胞共转染Flag-Fbxw7和HA-YAP,免疫共沉淀检测Fbxw7与YAP之间的相互作用;Flag-Fbxw7转染过表达HA-YAP的HepG2细胞,免疫共沉淀检测YAP蛋白泛素化水平变化;CHX追踪分析检测Fbxw7过表达对HepG2细胞中YAP蛋白半衰期的影响。7.HA-YAP 转染 Fbxw7 过表达的 Hep3B 细胞,Western blot 检测 Fbxw7 和 YAP 蛋白表达变化,流式细胞术、Caspase3/7活性分析、BrdU细胞增殖分析和MTT法检测细胞增殖和凋亡变化。8.分别应用稳定转染EV、Flag-Fbxw7及Flag-Fbxw7+HA-YAP的Hep3B细胞构建裸鼠皮下种植瘤模型,绘制肿瘤生长曲线;免疫组化和TUNEL技术检测各组瘤体标本中YAP、Ki-67和凋亡变化。结果:1.Fbxw7在HCC组织中的表达水平显著低于对应癌旁组织(P0.01);Fbxw7蛋白在较大肿瘤体积(≥5cm)、血管侵犯、高TNM分期和高病理分级的HCC组织中表达显著降低(P0.05)。2.所有细胞系中均能检测到Fbxw7 mRNA表达,其在LO2细胞中表达最高,SMMC-7721细胞中表达最低。3.Fbxw7过表达诱导HepG2细胞凋亡和生长停滞(P0.01);敲低Fbxw7导致Hep3B细胞凋亡抵抗和生长加速(P0.01)。4.YAP在HCC组织中的表达水平显著高于对应癌旁组织(P0.01);Fbxw7与YAP蛋白表达呈显著负相关(r=-0.572,P=0.003)。5.在HepG2细胞中过表达Fbxw7不影响YAP mRNA表达,但下调YAP蛋白水平(P0.01);在Hep3B细胞中敲低Fbxw7不影响YAP mRNA表达,但导致YAP蛋白蓄积(P0.01)。6.Fbxw7与YAP蛋白存在相互作用,过表达Fbxw7导致HepG2细胞中YAP蛋白泛素化水平升高且半衰期缩短。7.恢复YAP蛋白表达能够部分消除Fbxw7诱导的Hep3B细胞体外凋亡和生长阻滞(P0.01)。8.Fbxw7显著抑制Hep3B细胞体内生长,恢复YAP蛋白表达能部分逆转Fbxw7对Hep3B细胞的体内凋亡诱导和生长抑制作用(P0.01)。结论:1.Fbxw7低表达与HCC恶性临床病理特征相关,且Fbxw7与癌蛋白YAP表达呈显著负相关,Fbxw7可能作为潜在的HCC患者预后指示分子。2.Fbxw7通过泛素化蛋白酶解负向调控YAP蛋白的稳定性,YAP可能是Fbxw7的一个新靶蛋白。3.YAP蛋白能部分逆转Fbxw7对HCC细胞的体内外凋亡诱导和生长抑制作用,Fbxw7可能通过Hippo-YAP信号通路发挥抑癌功能。
[Abstract]:Background : Primary liver cancer ( PLC ) is one of the most common malignant tumors in China . The mortality of HCC is more than 90 % of PLC . p53 - / + Fbxw7 - / + knockout mice and irradiated Fbxw7 - / + mice spontaneously produce a variety of tumors , including HCC , suggesting that Fbxw7 is associated with the development of HCC . The expression of Fbxw7 mRNA in HCC and HCC cell line HepG2 , Hep3B , 7721 , BEL - 7402 and Huh7 were determined by immunohistochemical staining , Western blot and Western blot . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) . The expression of Fbxw7 in HCC tissues was significantly lower than that in adjacent tissues ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：西安交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 马祖祥;赵维玲;李永柏;高晓洁;杨军;孙平;李成荣;;特发性肾病综合征患儿外周血单个核细胞泛素的表达及意义[J];中国中西医结合肾病杂志;2006年10期

2 王素霞;刘媛;吴慧娟;张志刚;;去泛素化酶的研究及其进展[J];临床与实验病理学杂志;2008年06期

3 吴怡;刘新;;蛋白质泛素化、去泛素化与肿瘤发生的关系[J];沈阳医学院学报;2008年01期

4 茅幸;张志刚;吴慧娟;;泛素特异性加工酶2的研究进展[J];国际病理科学与临床杂志;2012年05期

5 何洪智;赵晓航;张立勇;吴e，

本文编号：1396656