sigma-1受体缺失对多巴胺神经元的影响及其机制研究

发布时间：2018-01-10 03:06

本文关键词：sigma-1受体缺失对多巴胺神经元的影响及其机制研究　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：sigma-1受体(σ_1R)是含有223个氨基酸残基的G蛋白偶联受体,在海马锥体神经元、黑质多巴胺神经元和胶质细胞选择性高表达。胞膜σ_1R激活能促进N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体的钙离子内流,增加谷氨酸和多巴胺的释放。定位于内质网的σiR参与内质网向线粒体的钙信号传递和钙平衡的维持。帕金森病(Parkinson's disease,PD)是以静止性震颤、随意运动迟缓等运动协调障碍为临床症状的神经退行性疾病。PD的主要病理特征是黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)多巴胺神经元丢失和Lewy小体形成。σ_1R密度在PD患者黑质-纹状体区域低于正常人。σ_1R基因敲除(σ_1R-/-)小鼠出现年龄相关的运动功能损害。虽然σ_1R-/-小鼠发生脊髓αα运动神经元死亡,但是σ_1R缺失是否影响黑质的多巴胺神经元迄今还未见有报道。α-synuclein(αSyn)的聚集体和纤维化是Lewy小体形成的主要病理机制。阻断σ_1R通过扰乱内质网-线粒体间的钙平衡,诱导蛋白酶体活性降低和内质网应激。内质网应激可以促进αSyn的聚集体和磷酸化。此外,σ_1R活化能减少细胞膜脂筏中神经节苷脂GM1组分。GM1与αSyn结合能促进αSyn的聚集体和纤维化形成。以上研究报道提示,σ_1R缺失可能会影响多巴胺神经元的αSyn聚集和磷酸化。因为αSyn聚集、纤维化和磷酸化都有一定的细胞毒性,是PD脑多巴胺神经元丢失的重要病理机制。因此,本课题将研究σ_1R-/-小鼠的运动协调障碍是否与黑质区αSyn聚集体形成和磷酸化,及其造成的多巴胺神经元损害有关。星形胶质细胞表达σ_1R。PD脑有大量活化的星形胶质细胞、小胶质细胞和神经炎性因子水平的增加。神经毒素MPTP或6-羟基多巴引起多巴胺神经元死亡,同时也刺激星形胶质细胞和小胶质细胞的活化,提示多巴胺神经元损伤的炎症病理机制。有研究报道,甲基苯丙胺处理星形胶质细胞可通过活化σ_1R能提高ERK1/2磷酸化和CREB转录水平,进而促进GFAP的表达。此外,甲基苯丙胺通过上调多巴胺转运体(DAT)、囊泡单胺转运蛋白2(VMAT2)或NMDA受体钙离子内流,促进多巴胺释放,发挥神经毒性作用。阻断σ_1R能抑制NMDA受体NR2B磷酸化,减少NMDA受体的钙离子内流。但是,PD脑σ_1R减少是否与黑质的多巴胺神经元丢失有关迄今没有报道。研究目的1.明确σ_1R对多巴胺神经元的影响及其分子机制。2.探讨σ_1R缺失对MPTP诱导神经毒性的作用及其调控机制。第一部分σ_1R对多巴胺神经元的影响及其分子机制材料与方法1.用PCR方法鉴定σ_1R-/-小鼠。本研究使用3月龄、6月龄和9月龄的雄性σ_1R-/-小鼠和同窝野生型(WT)小鼠。2.用匀速和加速转棒实验检测小鼠的运动协调和平衡功能。3.用σ_1R和TH免疫组织染色,Hochest染色。SNpc的TH阳性(TH+)细胞和Hochest阳性(Hochest+)细胞计数。4.用免疫印记方法检测黑质区σσ_1R、可溶性及不可溶性的αSyn、磷酸化αSyn、磷酸化 eIF2a、CHOP。5.用荧光测定法分析黑质区蛋白酶体活性。结果1.与同龄WT小鼠相比,6月龄和9月龄σ_1R-/-小鼠从匀速或加速转棒上的掉落时间减少,而3月龄σ_1R-/-小鼠在转棒上的停留时间没有明显差异——σ_1R缺失引起年龄相关的运动协调功能减退。2.WT小鼠SNpc多巴胺神经元表达σ_1R。与同龄WT小鼠相比,6月龄和9月龄σ_1R-/-小鼠SNpc的TH+细胞数目减少和Hochest+细胞增多,而3月龄σ_1R-/-小鼠TH+细胞和Hochest+细胞数目没有明显改变——σ_1R缺失引起年龄相关的多巴胺神经元死亡。3.6月龄和9月龄σ_1R-/-小鼠黑质不可溶αSyn聚集体(70-100 kD)水平明显增高,但是可溶αSyn单体(14 kD)没有明显变化。9月龄σ_1R-/-小鼠SNpc的多巴胺神经元中αSyn纤维化水平明显增加——σ_1R缺失引起年龄相关的αSyn聚集和纤维化。4.6月龄和9月龄σ11R-/-小鼠黑质的αSyn单体(14 kD)和聚集体(100 kD)磷酸化水平明显增加,伴有蛋白酶体活性的降低—σ_1R缺失增强αSyn磷酸化,降低蛋白酶体活性。5.与WT小鼠相比,6月龄和9月龄σ_1R-/-小鼠黑质的磷酸化eIF2a和CHOP蛋白水平明显增加,而3月龄σ_1R-/-小鼠没有明显改变——σ_1R缺失引起黑质神经元的内质网应激。6.在5月龄或8月龄σ_1R-/-鼠,GM1结合剂利福平(Rif)处理(30天)能部分减少αSyn聚集,但不影响αSyn磷酸化和蛋白酶体活性。在5月龄σ_1R-/-小鼠,内质网应激抑制剂salubrinal处理(30天)能抑制αSyn聚集和磷酸化,并提高蛋白酶体活性。在8月龄σ_1R-/-小鼠,salubrinal处理能抑制αSyn磷酸化,但是对αSyn聚集没有明显作用——σ_1R缺失→内质网应激→降低蛋白酶体活性→增加αSyn磷酸化→促进αSyn聚集;σ_1R缺失→增加脂筏GM1组分→易化αSyn聚集和纤维化。7.在5月龄或8月龄σ_1R-/-鼠,salubrinal处理(30天)能减少多巴胺神经元丢失,并缓解运动协调功能障碍。在8月龄σ_1R-/-小鼠,Rif处理(30天)能部分阻止多巴胺神经元丢失和运动协调功能损害——σ_1R缺失通过增加αSyn聚集和磷酸化引起多巴胺神经元毒性。小结σ_1R缺失引起年龄相关的αSyn聚集和磷酸化增加,引起进行性多巴胺神经元死亡,导致运动协调和平衡功能障碍(小结图)。第二部分σ_1R缺失对MPTP诱导神经毒性的作用及其调控机制材料与方法1.用PCR方法鉴定σ_1R基因敲除杂合子(σ_1R+/-)和纯合子(σ_1R-/-)小鼠。第一部分的研究已确定3月龄σ_1R-/-小鼠没有发生运动协调障碍、多巴胺神经元死亡、αSyn聚集和磷酸化,因此第二部分研究将采用3月龄σ_1R+/-小鼠和σ_1R-/-小鼠。2.整体试验:MPTP(20 mg/kg)连续5周进行皮下注射制备PD模型。离体试验:MPP+(500 μM)处理原代培养星形胶质细胞和小胶质细胞。3.行为学检测:用平衡木实验和转棒实验评价运动平衡和协调功能。4.TH、GFAP、Iba1免疫组织染色和Hochest染色。进行SNpc的TH+细胞、Hochest+细胞、GFAP+细胞和Iba1+细胞计数。5.用酶联免疫分析法(ELISA)检测黑质和培养细胞上清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。6.用蛋白免疫印记方法检测小鼠黑质脑区或培养细胞的DAT、VAMT2、GFAP、Iba1蛋白水平,ERK1/2和NR2B磷酸化水平。结果1.在MPTP末次给药的第5天后,MPTP处理的WT小鼠(MPTP小鼠)穿越平衡木时间比WT小鼠延长,从转棒上掉落时间明显缩短。与WT小鼠或σ_1R-/-小鼠相比,MPTP处理的σ_1R-/-小鼠(MPTP-σ_1R-/-小鼠)或σ_1R+/-小鼠(MPTP-σ_1R+/-小鼠)无论穿越平衡木的时间或者转棒的掉落时间并没有显著差异。用σ_1R阻断剂NE100连续6周处理能改善MPTP小鼠的运动协调和平衡功能。用σ_1R激动剂PRE084处理能使得MPTP-σ_1R+/-小鼠发生运动协调和平衡障碍——σ_1R缺失可以缓解MPTP引起的运动协调和平衡障碍。2.与WT小鼠相比,MPTP小鼠SNpc的TH+细胞减少和Hochest+细胞增多,但是MPTP-σ_1R-/-小鼠没有发生SNpc的TH+细胞减少和Hochest+细胞增加。与运动行为的结果相似,σ_1R阻断剂NE100能阻止MPTP小鼠TH+细胞减少,σiR激动剂PRE084引起MPTP-σ_1R+/-鼠发生TH+细胞丢失——σ_1R缺失对MPTP引起多巴胺神经元死亡有拮抗作用。3.WT小鼠SNpc的GFAP+4细胞表达σ_1R,而Iba1+细胞不表达。与WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠GFAP+细胞和Iba1+细胞形态和数量都没有明显的变化。与WT小鼠相比,MPTP小鼠和MPTP-σ_1R-/-小鼠SNpc的Iba1+细胞均增加大约30-40%。在MPTP小鼠,GFAP+细胞显示突起数量增多和变粗,细胞数量比WT小鼠增加2倍以上。在MPTP-σ_1R-/-小鼠,GFAP+细胞仅增加了 20%。σσiR阻断剂NE100能阻止MPTP-小鼠GFAP+细胞增加——σ_1R缺失能抑制MPTP刺激星形胶质细胞活化。4.在体外星形胶质细胞和小胶质细胞试验中,MPP+处理能增加星形胶质细胞GFAP表达和小胶质细胞的Iba1表达。MPP+处理星形胶质细胞和小胶质细胞培育液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α浓度也都明显增加。NE100能阻止MPP+促进星形胶质细胞的GFAP表达和释放炎性因子,但是对MPP+增加小胶质细胞的Iba1表达和炎性因子释放没有作用——阻断σ_1R能抑制MPP+刺激星形胶质细胞活化。5.在培养的星形胶质细胞,NE100处理能阻止MPP+增加ERK1/2的磷酸化水平。MEK抑制剂U0126能显著地抑制MPP+促进IL-6、IL-1β、TNF-α释放。在培养的小胶质细胞,NE100不影响MPP+增加ERK1/2的磷酸化。NE100和U0126对MPP+促进Iba1表达和IL-6、IL-1β、TNF-α释放没有明显的作用。6.与WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑质的NR2B磷酸化水平明显减少,MPTP小鼠NR2B磷酸化水平增加,MPTP-σ_1R-/-小鼠NR2B磷酸化水平增加不明显。NMDA受体激动剂NMDA能引起MPTP-σ_1R-/-小鼠TH+细胞缺失,而NR2B阻断剂Rσ25-6981能减少MPTP小鼠的TH+细胞缺失——σ_1R缺失通过降低黑质区NR2B磷酸化水平,阻止MPTP诱导神经细胞死亡。。7.与WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑质的DAT表达水平降低。NMDA能提高σ_1R-/-小鼠黑质的DAT表达。MPTP小鼠DAT表达明显减少。MPTP-σnR-/-小鼠DAT表达水平与σ_1R-/-小鼠相比没有明显的差异——σ_1R缺失引起DAT低表达能减少神经细胞内MPP+,以阻止MPTP诱导神经细胞死亡。8.与WT小鼠相比,σ_1R-/-小鼠黑质的VMAT2表达水平没有改变。NE100能阻止MPTP-WT小鼠的VMAT2蛋白水平明显降低,提示多巴胺神经细胞死亡导致VMAT2减少。小结σ_1R缺失通过抑制MPTP刺激星形胶质细胞活化或DAT表达,减少多巴胺神经元死亡和运动功能损伤(小结图)。总结和临床意义本研究的结果提示在PD患者早期黑质-纹状体σ_1R的减少或功能降低通过抑制神经炎症和神经兴奋毒性能减少多巴胺神经元死亡,而在PD患者中晚期σ_1R减少能促进αSyn聚集和磷酸化,增加多巴胺神经元死亡。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R742.5

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