调控巨噬细胞M2型极化的长链非编码RNA发现及小分子化合物的干预研究

发布时间：2018-01-10 11:29

本文关键词：调控巨噬细胞M2型极化的长链非编码RNA发现及小分子化合物的干预研究　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：巨噬细胞是造血系统中可塑性最强的免疫细胞,研究表明,巨噬细胞根据所处微环境刺激信号的不同,可极化为经典活化型巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和替代活化型巨噬细胞(M2型巨噬细胞),在正常发育、体内平衡、组织修复和对病原体的免疫反应中发挥着重要的作用。作为肿瘤微环境中最为常见的免疫细胞,存在于肿瘤组织中的巨噬细胞被称为肿瘤相关巨噬细胞,越来越多的研究表明肿瘤相关巨噬细胞具有M2样的表型,并且在肿瘤的发生和恶性演进中发挥着极重要的作用,被认为是可用于肿瘤治疗的药物作用靶细胞,但是调控肿瘤相关巨噬细胞M2型极化的具体分子机制一直是该领域的研究难点,尚无突破性进展。长链非编码RNA(Longnon-codingRNA,lncRNA)是一类转录本长度超过200个碱基的RNA分子,它们并不编码完整的蛋白,而是以RNA的形式在细胞内调控基因的表达水平从而影响生命活动,被认为是一个调控生命的全新"维度"。近年来已有文献表明lncRNA在调控细胞分化中起着重要的作用,但对于其与巨噬细胞M2型极化的调控却鲜见报道。本文将利用经典的M2型巨噬细胞极化因子,构建稳定的体外M2型极化模型,应用lncRNA基因芯片技术,鉴定在M2型极化过程中发挥调控作用的关键lncRNA,并在此基础上深入研究其调控巨噬细胞M2型极化的分子机制;在此基础上发现对关键lncRNA及巨噬细胞M2型极化具有干预作用的小分子化合物,研究其干预作用的分子机制,探讨小分子化合物对于肿瘤发生发展的影响,以期从巨噬细胞M2型极化出发为干预肿瘤的发生带来新的思路。第一部分调控巨噬细胞M2型极化的lncRNA发现及其作用机制研究研究目的:本部分旨在发现在巨噬细胞M2型极化过程中起调控作用的lncRNA,研究其介导巨噬细胞M2型极化的分子机制以及对巨噬细胞生物学功能的影响,为干预肿瘤相关巨噬细胞M2型极化提供潜在的靶点。研究方法:本部分研究采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7和小鼠原代巨噬细胞BMDM作为研究对象。(1)通过流式细胞术检测经典刺激因子IL4和IL13对巨噬细胞M2型极化的表面标记物CD206和CD209的表达影响,以考察巨噬细胞M2型极化情况;(2)在构建稳定模型的基础上,收集不同来源巨噬细胞,不同刺激时间的样本进行基因芯片技术分析相关差异lncRNA的表达;(3)通过siRNA技术干扰目标lncRNA的表达,通过流式细胞术和Real-time PCR技术检测巨噬细胞M2型极化的相关标记物的表达情况;(4)Transwell小室法检测siRNA技术干扰目标lncRNA的表达后,对肿瘤细胞运动迁移能力的影响;(5)通过管腔形成实验检测siRNA技术干扰目标lncRNA的表达后,对脐静脉内皮细胞管腔形成能力的影响;(6)Western blot法检测siRNA技术干扰目标lncRNA的表达后,巨噬细胞M2型极化相关信号通路的变化情况。研究结果:(1)应用M2型极化诱导因子IL4或IL13诱导发生M2型极化,通过流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物CD206和CD209,发现在RAW264.7细胞和BMDM细胞中,IL4或IL13均能诱导M2型表面标记物CD206和CD209表达增加。(2)应用IL13作用于RAW264.7细胞和BMDM细胞,通过lncRNA基因芯片技术测序发现:RAW264.7细胞中,共有55个lncRNA在不同时间点均发生5倍以上增加,BMDM细胞中共有104个lncRNA发生5倍以上增加;其中发生增加的lncRNA共有9个,数据库比对发现lncRNA-RIK可能具有调控巨噬细胞M2型极化的作用。(3)应用Real-time PCR技术检测LPS、IL4和IL13不同因子刺激巨噬细胞发生M1型和M2型极化之后lncRNA-RIK表达水平变化,发现lncRNA-RIK特异性地在M2型极化过程中发生增加(在RAW264.7细胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表达水平分别增加8.39 ± 2.94倍和8.17 ± 3.77倍,p值分别为0.0486和0.0301;在BMDM细胞中,IL4或IL13刺激后lncRNA-RIK表达水平分别增加2.02 ± 0.31倍和3.78 ± 0.36倍,p值分别为0.0049和0.0002)。(4)通过siRNA技术干扰巨噬细胞中lncRNA-RIK的表达后,巨噬细胞在IL4或IL13刺激下的M2型极化受到显著抑制(各组别p值均小于0.05);(5)通过Transwell实验发现M2型巨噬细胞条件培养基能够促进肿瘤细胞的迁移运动能力,但是沉默lncRNA-RIK的表达后不能逆转此作用。(6)采用管腔形成实验发现M2型巨噬细胞条件培养基能够促进HUVEC细胞管腔形成能力,但是沉默lncRNA-RIK的表达后不能逆转此作用。(7)Western blot检测发现IL4或IL13作用巨噬细胞后,M2型极化相关转录因子STAT6原型蛋白未发生改变,磷酸化化水平增加,沉默lncRNA-RIK的表达后,STAT6的磷酸化水平下降。研究结论:lncRNA-RIK通过抑制转录因子STAT6的磷酸化水平调控巨噬细胞的M2型极化,干扰lncRNA-RIK的表达可影响M2型巨噬细胞的促进血管生成能力,提示lncRNA-RIK可能是调控巨噬细胞M2极化的关键因子。第二部分干预巨噬细胞M2型极化相关IncRNA的小分子化合物Fenretinide的发现及其机制研究研究目的:基于所发现的调控巨噬细胞M2型极化的lncRNA-RIK,我们筛选发现抗肿瘤候选化合物Fenretinide(4-HPR)对lncRNA-RIK的表达具有抑制作用。因此,本部分将进一步评价4-HPR对lncRNA-RIK及巨噬细胞M2型极化的调控作用,在此基础上探讨4-HPR抑制巨噬细胞M2型极化的分子机制,研究巨噬细胞M2型极化在4-HPR介导肿瘤预防中的作用地位,为4-HPR的临床应用提供理论基础。研究方法:本研究采用小鼠巨噬细胞系RAW264.7、原代巨噬细胞BMDM和结肠癌细胞株(HCT116,SW620和SW480)作为研究对象。(1)应用Real-timePCR技术检测4-HPR作用巨噬细胞后,考察lncRNA-RIK表达水平变化;(2)通过流式细胞术检测巨噬细胞M2型极化的表面标记物CD206的表达来考察4-HPR对于巨噬细胞M2型极化的影响,通过Real-time PCR技术检测4-HPR对于巨噬细胞M2型极化标记物mRNA水平的影响;(3)采用管腔形成实验,考察给予4-HPR作用后,M2型巨噬细胞条件培养基对HUVEC管腔形成的能力的影响;(4)Western blot检测给予4-HPR作用后,巨噬细胞M2型极化相关信号通路STAT6的激活情况;(5)体内实验应用转基因小鼠APCmin/+自发结肠癌的动物模型,考察4-HPR对于肠道肿瘤发生的影响;(6)通过免疫组化方法检测4-HPR处理小鼠的肠道组织中的M2型巨噬细胞相关蛋白的表达情况;(7)通过免疫组化方法检测4-HPR处理小鼠的肠道组织中的血管生成情况。研究结果:(1)应用Real-timePCR技术检测发现,刺激因子IL4和IL13可诱导lncRNA-RIK表达增加,但是4-HPR作用后lncRNA-RIK表达水平降低(IL4单用组较与4-HPR联合应用组相比,由6.09 ± 1.83倍下降至0.12 ± 0.03倍,p=0.0051;IL13单用组较与4-HPR联合应用组相比,由8.18 ±3.08倍下降至0.18 ±0.09倍,p=0.0020)。(2)采取两个体外模型评价4-HPR对巨噬细胞M2型极化的抑制作用,通过流式细胞术检测巨噬细胞表面标记物CD206,结果显示4-HPR可明显抑制IL4或IL13诱导的巨噬细胞细胞M2型极化标记物的表达。(3)应用Real-timePCR技术进一步发现4-HPR可抑制巨噬细胞M2型极化的特异性基因Fizz-1和PPAR-γ的mRNA水平。(4)为了探讨4-HPR抑制巨噬细胞M2型极化的机制,首先考察活性氧簇在巨噬细胞M2型极化过程中发挥的作用,结果发现还原性物质NAC和GSH,均不能逆转4-HPR对巨噬细胞M2型极化的抑制作用,提示4-HPR调控巨噬细胞M2型极化与经典的氧化应激途径无关。(5)Western Blot进一步考察调控巨噬细胞极化的经典信号通路JAK2-STAT6信号通路发现4-HPR作用巨噬细胞后,可抑制转录因子STAT6的磷酸化水平,从而影响巨噬细胞的M2型极化。(6)采用管腔形成实验,发现M2型巨噬细胞条件培养基能够促进HUVEC细胞管腔形成能力,给予4-HPR作用的M2型巨噬细胞条件培养基可抑制HUVEC管腔形成能力。(7)采用APCmin/+转基因小鼠自发肠道肿瘤的动物模型,检测4-HPR的肿瘤预防作用,结果显示20mg/kg的4-HPR可以显著减少肠道肿瘤的数目(对照组平均肿瘤发生数目为14±8个,4-HPR给药组为6±7个,p=0.0088)。(8)免疫组化方法检测小鼠的肠道组织中的M2型巨噬细胞标记物CD206的表达,发现4-HPR处理小鼠的肠道组织中CD206的表达减少。(9)免疫组化方法检测小鼠的肠道组织中的血管标记物CD31的表达,发现4-HPR处理小鼠肠道肿瘤部位的CD31表达减少。(10)免疫组化检测Ki67的表达,发现4-HPR并不影响小鼠肠道肿瘤细胞的增殖;TUNEL染色检测小鼠肠道肿瘤细胞的凋亡情况,发现4-HPR不引起肿瘤细胞凋亡。研究结论:筛选得到调控lncRNA-RIK表达的小分子化合物4-HPR,可抑制巨噬细胞的M2型极化,并且可以抑制转录因子STAT6的磷酸化水平。进一步实验发现4-HPR可通过干预巨噬细胞M2型极化发挥预防肠道肿瘤的作用,提示4-HPR是一个有效抑制巨噬细胞M2型极化的小分子化合物,具有进一步研究的价值。
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【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

【参考文献】