不同方法纯化颗粒脂肪的效果评价及其对移植后转归的影响

发布时间：2018-01-11 01:13

本文关键词：不同方法纯化颗粒脂肪的效果评价及其对移植后转归的影响　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：自体脂肪移植术(autologus fat transplantation,AFT),又称自体脂肪注射,是利用自身脂肪组织作为填充材料修复皮下软组织缺损一种手段。与人造材料和异种材料相比,自体脂肪获取便捷,价格低廉且具有更好生物相容性,在整形美容外科中的应用非常广泛。临床工作中,移植后脂肪的存活情况是医患双方最为关注的问题,而抽吸后脂肪的纯化处理与脂肪组织的存活情况直接相关。目的对棉垫吸附(AWG,Absorptionwithgauze)法、离心分离(CEN,Centrifugation)法以及静置沉淀(DEC,Decantation)法纯化处理脂肪的效果进行评价,并在动物实验中对移植物转归进行比较分析,以初步探索其影响移植物存留和转归的具体机制。方法将人腹部来源的抽吸颗粒脂肪分别经棉垫吸附法、离心分离法、静止沉淀法进行纯化处理。在体外实验中,将纯化后脂肪经高速离心处理,使得液体成分、油脂、脂肪组织分离,测量各自体积以评价不同方法的纯化效力。通过组织学检测和代谢功能检测对不同方法纯化后脂肪组织的结构和功能完整性进行比较;经胶原酶消化获得脂肪组织中的血管周围基质成分(Stromal Vascular Fraction,SVFs),利用流式细胞分析仪对中的细胞成分进行分析;将SVFs细胞贴壁培养至第三代,获得脂肪间充质干细胞(Adipose-Derived Stem Cells,ADSCs,)利用 CCK8(Cell Counting Kit-8)试剂绘制细胞增殖曲线,并对其细胞周期和凋亡情况进行检测,通过成脂、成骨、成软骨分化对其分化活性进行比较;使用免疫缺陷小鼠构建颗粒脂肪移植的动物模型,于注射后3天,6天,9天,12天,3周,6周,9周,12周取出移植后脂肪。通过称取移植物重量、测量体积对不同方法纯化后脂肪组织的存留情况进行比较;组织学用脂周蛋白染色标记活性良好的脂肪细胞,比较不同方法纯化后脂肪在体内的存活情况。利用液相芯片、Western blot、实时荧光定量PCR,从血管再生、炎性物质表达、基质金属蛋白酶的表达与胶原重构等几个方面观察脂肪移植物的体内转归,进而探索不同的颗粒脂肪纯化方法对脂肪移植物存留的影响。结果不同方法纯化后脂肪中含水量由高到低依次为:静止沉淀组、离心分离组、棉垫吸附组;与之相反,脂肪组织的含量由高到低依次为:棉垫吸附组、静置沉淀组、离心分离组;而离心组纯化脂肪高速离心后,分离出的油脂高于静止组和棉垫组。不同方法纯化后脂肪组织在结构完整性、葡萄糖代谢能力等方面均无显著差异。不同方法纯化后脂肪组织中SVFs及ADSCs的含量由高到低依次为:棉垫组、离心组、静止组。而红细胞的含量由高到低依次为:静止组、离心组、棉垫组。三种纯化方法对ADSCs的增殖活性、细胞周期和凋亡情况的影响基本一致。三种方法对ADSCs分化活性的影响无明显差异。移植后脂肪体积随着时间延长呈现下降趋势,但随着时间延长下降幅度逐渐减小。在移植后各个时间点,移植物体积比较:棉垫组离心组静止组,差异有统计学意义。在移植后各个时间点,移植物重量比较:棉垫组离心组静止组。且下降幅度大于体积。组织学检测可以发现,脂肪移植后脂肪组织的转归趋势为:脂肪细胞退变(去分化和崩解坏死)并伴随炎性物质表达增加→形成囊腔结构→胶原沉积→血运重建→脂肪再生的基本趋势。离心分离法纯化后脂肪组织中在脂肪细胞退变过程中,更多发生脂肪细胞的崩解坏死,少见去分化的脂肪细胞。利用蛋白液相芯片技术对移植后早期脂肪组织中细胞的早期凋亡情况进行检测,对于移植物中多种炎性因子的检测可以发现,多数炎性因子呈现低表达,IL-6,IL-1,GM-CSF,IFN-g在脂肪移植后早期显著增高后回落;IL-10、IL-12、IL13在脂肪组织中表达量极低,其表达不受是否植入体内和时间变化的影响。IL-2、IL-4、IL-5、IFN-G、TNF-α虽然在组织中有一定表达,但并未受到不同干预因素和移植处理的影响。离心分离组移植后早期炎性物质IL-6,IL-1表达更高,与静置沉淀法和棉垫吸附法纯化后脂肪组织间差异具有统计学意义。结论1.抽吸后脂肪组织的浓缩纯化效果与移植后脂肪的组织存留量直接相关:纯化浓缩效果越好,移植后脂肪组织的存留率越高。三种纯化方法相比较,棉垫吸附法纯化效果最好,离心分离法次之,静置沉淀法浓缩纯化效率最低。2.离心分离法(1200g离心力,3min)在纯化过程中对脂肪细胞造成了临界的机械损伤,在体外的功能检测中不易发现,但在移植后的失养环境中,脂肪细胞出现更多的崩解坏死。3.在免疫缺陷裸小鼠构建的脂肪移植模型中,脂肪组织的体内转归可以划分为三个阶段(1)快速损耗与炎症启动期(D1-D7)—移植物中液体成分的快速吸收,移植物存留量减少,同时炎性物质表达逐渐增加;(2)脂肪退变与血运重建期(W1-W3)—脂肪细胞发生崩解坏死和去分化,炎性物质迅速到达峰值后回落,新生血管逐渐形成(3)基质重构与脂肪再生期(W3-)---前期大量胶原沉积,后期逐渐降解,新生脂肪细胞出现并逐渐增多。4.良好的浓缩效果,使得棉垫吸附组和离心分离组移植物中的ASCs富集,移植后脂肪中VEGFR表达高,胶原重构发生早,有益于脂肪细胞的再生。5.由于脂肪细胞活性受损,离心分离法纯化后脂肪组织移植后IL-1,IL-6等炎性物质表达增高。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R622.9

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