鹅膏肽类毒素检测方法建立及其在鹅膏菌属中分布研究

发布时间：2018-01-12 12:22

本文关键词：鹅膏肽类毒素检测方法建立及其在鹅膏菌属中分布研究　出处：《中国疾病预防控制中心》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：蘑菇中毒导致的死亡占我国食物中毒死亡的35.6%,其中鹅膏菌属占约90%。肽类毒素是鹅膏菌属中导致肝脏损伤和致死的主要毒素。虽然有毒蘑菇的发现及其毒素确证对病因溯源、中毒救治和健康教育都具有十分重要的意义。但目前能够对毒蘑菇中毒案例中致病毒素展开研究,对病因正确溯源的却很少。这是由于:1、缺乏准确可靠的鹅膏毒肽检测方法,导致毒蘑菇毒素含量和构成的数据常常相互矛盾;2、对鹅膏菌属毒素含量及分布及动态变化规律不了解,难以评估健康风险;3、由于缺乏人体生物样本快速、简单、高通量检测方法,当无法获得现场标本时,无法通过病人体液生物样本确定致病毒素;4、由于天然毒素的化学结构多样性,未知鹅膏毒肽结构类似物可存在健康风险,仍需要不断探索。因此,本研究以中毒致死率最高的鹅膏肽类毒素为研究对象,1、建立蘑菇子实体中鹅膏肽类毒素准确可靠的检测方法,为可疑毒蘑菇的毒素确证提供依据;2、建立人体生物样本中鹅膏肽类毒素准确可靠的检测方法,为中毒早期临床诊断提支持;3、研究种属差异、组织部位、生长过程对鹅膏肽类毒素的分布影响;4、基于高分辨质谱,建立鹅膏肽类毒素非靶向筛查方法的建立并在剧毒鹅膏中筛查未知毒素,发现未知风险,并建立筛查数据库。1.蘑菇子实体中鹅膏肽类毒素的同时测定的UPLC-MS/MS方法目前,我国蘑菇中毒事件处理和患者救治中很少进行毒素检测。已开展研究中,对我国有毒鹅膏毒素成分组成、含量及分布规律了解有限,且时常相互矛盾。这有可能是毒素在种属间、组织部位和生长发育阶段分布差异造成的,也可能是检测方法带来的误差造成的。因此本研究建立了准确可靠的蘑菇子实体中鹅膏肽类毒素的LC-MS/MS检测方法。该方法采用稀释后直接进样方式,大大简化了样品前处理步骤,并有效控制了基质效应。方法学验证数据和实际样品应用证明该方法稳定、可靠、准确,能够满足毒素含量范围较大的鹅膏样品检测需求。2.生物样品中鹅膏肽类毒素的同时测定的UPLC-MS/MS方法在鹅膏菌中毒的救治中,早期正确诊断对病人的成功救治十分重要。因此需要建立人体生物样本中鹅膏毒肽(amatoxin)和鬼笔毒肽(phallotoxin)的快速毒素确证和定量方法。因此本研究建立了 a-amanitin,β-amanitin,γ-amanitin,phalloidin(PHD)和 phallacidin(PCD)在人体血浆、血清、尿液中的 LC-MS/MS同时测定方法。应用PRiME和μElution技术实现了高通量、快速、简单的样品净化,并优化了 UPLC-MS/MS方法进行检测。经完整的方法学验证,该方法具有满意的灵敏度、准确性和稳定性,适用于毒理学和临床应急检测。在2015年云南发生的多起毒蘑菇中毒事件中,利用该方法发现两例阳性病例,为病因确证提供了数据支持。3.鹅膏肽类毒素在鹅膏子实体中的分布研究本研究利用2012-2016年采集的鹅膏菌标本,对鹅膏菌属中主要毒素进行了分析,初步阐明鹅膏菌种属间毒素含量和组成存在很大差异。假淡红鹅膏(Amanita subpallidorosea)是本研究团队首次鉴定明确并发表的我国剧毒新种,本研究以假淡红鹅膏为代表系统分析了其组织部位、生长发育阶段对毒素含量分布的影响,发现毒素含量在不同组织和发育阶段变化很大。揭示鹅膏毒肽含量和分布是一个动态的过程,该研究对认识生物毒素变化规律提供了新启示。4.基于高分辨质谱的鹅膏肽类毒素非靶向筛查方法和筛查数据库的建立本研究探索了发现蘑菇中潜在新毒素的筛查策略,利用高分辨质谱PRM与AIF相结合的模式,建立了基于特征碎片的毒素筛查方法,并初步建立了特征碎片数据库。在6个剧毒鹅膏样品中发现了 11个环肽类毒素,其中4个鉴定为amaninamide、phallisacin、Alal-viroidin 和 viroidin,其他 7 个为新化合物。该研究为未知毒素进一步分离和确认,以及毒性和生物代谢产物合成通路研究研究提供了研究基础。通过本研究初步建立了基于离子碎片的鹅膏肽类毒素筛查库,并通过开放和可扩展的的数据库工作流程,实现新化合物的循环扩增。本研究首次在鳞柄鹅膏以外的种属中发现了 virotoxin类化合物,且含量很高。这一全新发现打破了对virotoxin的传统认知,并为从分类学角度确定假淡红鹅膏和鳞柄鹅膏的亲缘关系提供了线索。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R155.3

【相似文献】