PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍及对免疫炎症反应的影响

发布时间：2018-01-14 01:18

本文关键词：PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍及对免疫炎症反应的影响　出处：《兰州大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：PM2.5加剧慢性阻塞性肺疾病小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能障碍机制研究及党参多糖的保护作用背景与目的:大气污染物主要成分细颗粒物(空气动力学当量直径小于等于2.5μm的颗粒物,简称PM2.5)的浓度增加可导致呼吸系统疾病的发病率、就诊人次增加,慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)患者在PM2.5升高时更加容易发生急性加重,但具体机制不清。肺泡巨噬细胞(AM)吞噬功能降低可能与慢阻肺急性加重相关,但PM2.5对慢阻肺AM吞噬功能影响研究较少。传统中药党参因其免疫调节、抗炎、增强免疫力等作用被广泛应用于肺部疾病的预防和治疗,但因中药成分复杂,其具体作用机制不清,其主要成分党参多糖(CPP)具有提高巨噬细胞吞噬功能、抗氧化抗炎作用,但在慢阻肺中的应用鲜见报道。因此,本研究拟探讨PM2.5对慢阻肺小鼠AM吞噬功能缺陷的影响,PM2.5造成的肺组织氧化应激水平、肺组织和全身炎症反应水平,并探讨CPP对PM2.5加剧慢阻肺小鼠AM吞噬功能、氧化应激及炎症反应的保护作用及机制。方法:50只SPF级雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组、慢阻肺PM2.5组、慢阻肺CPP组、慢阻肺CPP+PM2.5组,每组10只。采用单纯香烟烟雾暴露连续90d建立慢阻肺小鼠模型,所有PM2.5干预组给予PM2.5(770μg/m3)雾化吸入连续90d,所有CPP干预组给予CPP(300mg/kg)灌胃连续90d。造模结束后采用小鼠无创体描箱检测肺功能,吸气峰流速(PIF)和呼气峰流速(PEF);颈椎脱臼法处死小鼠,经气管生理盐水全肺灌洗获得支气管肺泡灌洗液(BALF),无菌获取肺组织,检查其病理形态学改变,计算肺平均内衬间隔(MLI);采用不连续密度梯度离心法分离AM,流式细胞术检测AM吞噬荧光素异硫氰酸酯标记的大肠杆菌(FITC-E.coli)的能力,用平均荧光强度(MFI)、吞噬E.coli阳性细胞百分比(吞噬%)表示。分别用菲罗啉比色法、硫代巴比妥酸比色法、改良Hafeman法检测肺组织匀浆总抗氧化物能力(TAC)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)水平。用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测BALF和血清中白介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平。结果:1.小鼠肺功能:慢阻肺组PIF和PEF:(7.63±0.94)、(4.43±0.63)显著低于健康对照组组(11.85±1.28)、(7.38±0.82),慢阻肺PM2.5组PIF和PEF:(5.62±0.53)、(3.11±0.41)显著低于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺CPP组PIF和PEF:(8.79±0.51)、(5.98±0.34)和慢阻肺CPP+PM2.5组PIF和PEF(6.45±0.45)、(3.64±0.39)分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(均P0.01)。2.病理学改变:慢阻肺组肺组织有炎症细胞浸润和肺泡腔扩大、肺泡壁破坏等肺气肿改变,MLI比健康对照组显著扩大(55.51±2.17比32.92±1.30)(P0.01),慢阻肺PM2.5组上述改变较慢阻肺组严重,MLI(61.69±1.84)进一步扩大(P0.01),慢阻肺CPP组和慢阻肺CPP+PM2.5组则分别较慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组减轻,MLI(43.25±1.50、57.78±1.69)也较各自对照组缩小(P0.01)。3.AM吞噬功能:慢阻肺组MFI、吞噬%:(4939±924)、(30.90±5.19)%显著低于健康对照组(10222±1567)、(69.11±5.59)%(均P0.01),慢阻肺PM2.5组MFI、吞噬%:(3293±543)、(20.91±3.51)%显著低于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺CPP组MFI、吞噬%:(5903±484)、(38.53±2.84)%和慢阻肺CPP+PM2.5组MFI、吞噬%:(4064±418)、(26.88±1.84)%分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(均P0.01)。4.氧化应激水平:慢阻肺组TAC和GSH-PX:(6.83±0.36)、(46.49±2.59)显著低于健康对照组(17.99±0.09)、(84.32±5.65)(均P0.01),慢阻肺PM2.5组TAC和GSH-PX:(3.61±0.29)、(32.37±3.78)显著低于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺CPP组TAC和GSH-PX:(8.80±0.26)、(53.40±4.02)和慢阻肺CPP+PM2.5组TAC和GSH-PX:(5.43±0.30)、(42.42±3.95)分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(均P0.01)。慢阻肺组MDA水平(2.73±0.22)显著高于健康对照组(1.74±0.37)(P0.05),慢阻肺PM2.5组MDA水平(3.55±0.33)显著高于慢阻肺组(P0.01),慢阻肺CPP组MDA水平(2.22±0.28)和慢阻肺CPP+PM2.5组MDA水平(2.72±0.44)分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.01)。5.BALF和血清中IL-6、IL-8、TNF-α水平:慢阻肺组(1136.17±79.12、456.74±38.58)、(336.80±36.57、248.77±31.92)、(201.72±37.65、29.17±9.77)显著高于健康对照组(350.42±71.94、224.23±32.84)、(50.25±7.79、62.65±11.90)、(44.58±20.35、0.60±0.35)(均P0.01),慢阻肺PM2.5组(1351.67±41.64、753.64±44.39)、(562.38±39.37、535.94±51.09)、(401.49±35.98、46.76±11.17)显著高于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺CPP组(762.33±32.79、365.63±39.21)、(289.02±48.57、143.14±33.66)、(134.35±35.34、14.63±4.93)和慢阻肺CPP+PM2.5组(778.17±20.07、558.73±38.07)、(427.27±36.35、331.53±43.59)、(258.09±36.74、34.72±11.94)分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(均P0.01)。6.相关性分析:基础状态下、PM2.5干预、CPP干预及PM2.5联合CPP干预后,慢阻肺小鼠MFI和吞噬%与TAC、GSH水平均呈正相关,与MDA水平呈负相关;慢阻肺小鼠MFI和吞噬%与BALF和血清中IL-6、IL-8、TNF-α均呈负相关(P0.05或P0.01)。结论:1.单纯香烟烟雾暴露法可复制慢阻肺小鼠模型;2.慢阻肺小鼠AM吞噬大肠杆菌能力低下,肺组织处于氧化应激状态,肺组织局部和全身炎症反应增强;3.PM2.5损害慢阻肺小鼠AM的吞噬能力,并加重氧化应激、恶化肺组织局部及全身炎症反应;4.CPP对慢阻肺小鼠和PM2.5干预后的慢阻肺小鼠AM均有保护作用,可改善其吞噬能力、氧化应激状态、肺局部及全身炎症状态;5.CPP对AM吞噬能力的保护作用与其抗氧化、减轻炎症作用密切相关。PM2.5对慢性阻塞性肺疾病小鼠Th17/Treg失衡及免疫炎症反应的影响背景与目的:T细胞亚群比例失衡及其导致的细胞炎症因子分泌异常,从而引发异常的免疫炎症反应是慢阻肺重要的发病机制之一,Th17细胞过度增多而Treg细胞不能有效抑制可导致Th17细胞分泌过多的IL-17参与形成气道慢性炎症,而Treg分泌的IL-10减少则使得炎症不能消散,参与慢阻肺的发病,但PM2.5对慢阻肺Th17、Treg细胞比例变化及IL-17、IL-10分泌的影响尚不清楚;Delta1、4-Notch1通路参与未分化T细胞向不同的亚群方向分化,但在慢阻肺中,AM上配体Delta1/4、T细胞上受体Notch1表达变化在Th17和Treg分化中的作用及PM2.5对该通路的影响研究较少;IL-6亦参与Th17细胞的分化调控,但在慢阻肺中IL-6是否参与调控及PM2.5对其的影响尚不清楚;AM可释放IL-6等细胞因子,引发炎症反应,但其是否可经此途径参与调控Th17/Treg细胞失衡尚未见报道。因此本研究探讨PM2.5对慢阻肺小鼠Th17、Treg细胞比例、Th17/Treg比值失衡及相关细胞因子IL-17、IL-10产生的影响及与AM Delta1/4配体表达、脾脏T细胞Notch1受体表达、血清IL-6水平的关系。方法:50只SPF级雄性BALB/c小鼠按照随机数字表法分为正常对照组、慢阻肺组、慢阻肺PM2.5组、慢阻肺GSI(Notch信号通路特异性抑制剂γ分泌酶抑制剂)组、慢阻肺GSI+PM2.5组,每组10只。采用单纯香烟烟雾暴露连续90d建立慢阻肺小鼠模型,所有PM2.5干预组给予PM2.5(770μg/m3)雾化吸入连续90d,所有GSI干预组自造模第61d至第90d隔日给予腹腔注射GSI(1mg/kg)。造模结束后采用小鼠无创体描箱检测肺功能,PIF和PEF;颈椎脱臼法处死小鼠,无菌获取肺组织,检查其病理形态学改变,计算MLI;采用不连续密度梯度离心法分离AM,连续密度梯度离心法、尼龙毛柱法分离提纯脾脏T细胞。流式细胞术检测Th17、Treg细胞占CD4阳性T细胞的百分比并计算Th17/Treg比值,实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测AM上Delta1/4、T细胞Notch1的m RNA表达,免疫印迹法检测Delta1/4、Notch1蛋白表达,ELISA法检测血清中IL-6、IL-17、IL-10水平。结果:1.肺功能及病理学改变:慢阻肺组PIF和PEF(7.63±1.12)、(4.44±0.70)显著低于健康对照组(12.03±1.35)、(7.17±0.63)(P0.01)。慢阻肺组出现明显的支气管炎症和肺气肿改变,健康对照组未出现上述改变,慢阻肺组MLI(56.31±3.27)明显比健康对照组(33.32±2.28)扩大(P0.01),慢阻肺模型小鼠符合慢阻肺特征性改变。2.Th17亚群比例:慢阻肺组(17.69±5.08)显著高于健康对照组(5.59±1.49),慢阻肺PM2.5组(32.16±6.06)显著高于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺GSI组(12.11±1.83)和慢阻肺GSI+PM2.5组(27.57±7.38)分别显著第于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.05或P0.01)。Treg亚群比例:慢阻肺组(0.84±0.29)显著低于健康对照组(1.18±0.60),慢阻肺PM2.5组(0.45±0.16)显著低于慢阻肺组(P0.05),慢阻肺GSI组(1.15±0.25)和慢阻肺GSI+PM2.5组(0.77±0.23)分别显著高于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.05或P0.01)。Th17/Treg比值:慢阻肺组(22.50±7.72)显著高于健康对照组(5.81±3.03),慢阻肺PM2.5组(77.32±22.14)显著高于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺GSI组(11.07±3.13)和慢阻肺GSI+PM2.5组(38.72±15.04)分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.05或P0.01)。3.Delta1、Delta4、Notch1 m RNA和蛋白表达:慢阻肺组(6.34±0.88、0.78±0.05)、(10.03±1.32、0.70±0.06)、(11.56±1.39、0.51±0.07)显著高于健康对照组(1.20±0.72、0.54±0.48)、(1.06±0.38、0.51±0.07)、(1.03±0.28、0.29±0.05)(均P0.01),慢阻肺PM2.5组(9.97±3.38、1.05±0.07)、(19.08±3.40、0.88±0.05)、(23.11±5.98、0.77±0.06)显著高于慢阻肺组(P0.05或P0.01),慢阻肺GSI组(2.23±0.56、0.69±0.05)、(7.27±1.27、0.63±0.05)、(7.74±1.01、0.41±0.05)和慢阻肺GSI+PM2.5组(4.00±3.54、0.90±0.10)、(12.66±2.07、0.77±0.06)、(17.05±2.40、0.63±0.06)分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.05或P0.01)。4.血清IL-6、IL-17、IL-10水平:慢阻肺组(492.64±61.05、60.70±2.57、2.60±0.47)显著高于健康对照组(224.13±33.67、44.14±3.86、4.15±1.41)(均P0.01),慢阻肺PM2.5组(744.70±42.78、71.15±3.69、0.57±0.19)显著高于慢阻肺组(均P0.01),慢阻肺GSI组(430.42±43.21、54.30±3.00、3.32±0.14)和慢阻肺GSI+PM2.5组(643.03±25.04、65.19±2.64、1.51±0.12)分别显著低于慢阻肺组和慢阻肺PM2.5组(P0.05或P0.01)。5.相关性分析:基础状态下、PM2.5干预、GSI干预及PM2.5联合GSI干预后慢阻肺小鼠:AM的Delta1、Delta4蛋白表达与血清IL-6水平呈正相关,与T细胞Notch1蛋白表达呈正相关;IL-6水平与Th17细胞比例呈正相关;Notch1蛋白表达与Th17比例呈正相关,与Treg比例呈负相关,与Th17/Treg比值呈正相关;Th17比例与血清IL-17水平呈正相关,Th17/Treg比值与IL-17水平呈正相关;Treg比例与血清IL-10水平呈正相关,Th17/Treg比值与IL-10水平呈负相关(P0.05或P0.01)。结论:1.慢阻肺小鼠存在Th17细胞升高为主的Th17/Treg失衡,导致IL-17水平升高,IL-10水平降低,慢阻肺小鼠存在Th17/Treg细胞失衡导致的炎症反应,PM2.5可加重该免疫炎症反应;2.慢阻肺小鼠AM上Delta1/4、T细胞上Notch1表达均上调,PM2.5可使慢阻肺小鼠Delta1/4-Notch1的表达进一步上调;3.PM2.5干预前后,慢阻肺小鼠Th17细胞升高为主的Th17/Treg失衡及IL-17水平升高的炎症反应状态与Delta1/4、Notch1表达均上调有关,GSI可部分逆转PM2.5干预前后慢阻肺小鼠的免疫炎症反应,与其抑制Delta1/4-Notch1通路活化相关;4.慢阻肺小鼠血清IL-6含量增加,PM2.5加剧IL-6的过度释放,参与调控Th17比例异常升高;AM Delta1/4表达上调与IL-6含量增加有关,推测AM可能参与IL-6的异常释放,导致Th17细胞异常升高,参与PM2.5干预前后慢阻肺的免疫炎症反应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R563.9

【参考文献】