SEMA3F通过抑制Rac1调节结直肠癌细胞干性的机制及临床病理学意义

发布时间：2018-01-15 11:11

本文关键词：SEMA3F通过抑制Rac1调节结直肠癌细胞干性的机制及临床病理学意义　出处：《第三军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结直肠癌是严重危害人类健康的恶性消化道肿瘤,《全球癌症报告2014》数据提示中国新增的癌症例数及死亡人数的总和居世界首位,其中以包括结直肠癌在内的消化道恶性肿瘤与其他系统肿瘤相比发生率较高。因此,深入研究结直肠癌的发生与发展的主要机制,探讨肿瘤形成过程中的分子基础及作用机制,将为未来的结直肠癌患者的个性靶向治疗提供新的理论基础。近年来,肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论的提出为结直肠癌的治疗提供了新的思路。我们前期研究证实神经轴突导向分子SEMA3F具有抑制结直肠癌细胞的转移潜能及体内成瘤能力,但SEMA3F对肿瘤细胞干性特征的影响及分子机制未见报道。神经丛素A1(Plexin A1)作为SEMA3F的受体,胞内具有能够活化GTPase的结构域,使其实现GDP非激活形式与GTP激活形式的转换,它可以传导SEMA3F对细胞的增殖、迁移及运动能力的调节。近年来研究发现,GTPase还能够参与肿瘤干细胞的干性维持。同时我们前期预实验结果提示结直肠癌干细胞低表达轴突导向因子SEMA3F,此外,SEMA3F的表达还与肿瘤的恶性程度呈负相关关系,提示神经轴突诱导因子SEMA3F可能在肿瘤的起始过程中发挥着重要作用。因此我们推测SEMA3F可能通过靶向GTPase对结直肠癌细胞的干性特征具有抑制作用。在本研究中,我们通过体内构建SEMA3F Sh RNA干扰载体及过表达的慢病毒,将其转导至人结直肠癌细胞系,观察调节SEMA3F的表达对结直肠癌细胞的自我更新能力及体内成瘤能力的影响,观测调节SEMA3F的表达对相关信号通路的影响,特别是Wnt/β-Catenin信号通路激活的影响。重点检测了GTPase在改变调节SEMA3F表达后的改变情况,通过外源性抑制剂及小干扰RNA的处理,验证其在SEMA3F调控结直肠癌细胞干性特征过程中的作用。最后,我们调研了人类结直肠癌标本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表达状况,探寻三者与肿瘤发生与转移相关的肿瘤病理学特征之间的关系。主要结果和结论如下:1.SEMA3F可以显著抑制结直肠癌细胞的干性特征;(1)过表达SEMA3F的表达后可以显著抑制结直肠癌细胞系中相关干性基因的表达(如Nanog、Oct4、Sox2);(2)干扰SEMA3F的表达后可以显著增强结直肠癌细胞中的Nanog、Oct4、Sox2的表达水平;(3)上调SEMA3F的表达后可以显著抑制结直肠癌细胞系HCT116的LGR5的表达水平;(4)上调SEMA3F的表达后可以显著抑制结直肠癌细胞系HCT116的LGR5阳性群体的比例(3.31%±0.33%、4.0%±0.83%,0.75%±0.15%,p0.05);(5)上调SEMA3F的表达后结直肠癌细胞系HCT116的克隆形成率由21.67±1.63%、21±1.70%下降到12.0±0.82%(p0.05),而结直肠癌细胞HCT116成球能力则由22.33±2.78%、20.67±1.72%下降到8±1.47%(p0.05);(6)干扰SEMA3F的表达后可以显著增加结直肠癌细胞系HCT116的LGR5的蛋白表达水平及LGR5阳性群体的比例(3.31%±0.33%、4.0%±0.83%,8.92%±1.15%,p0.05);(7)干扰SEMA3F的表达后,结直肠癌细胞系HCT116细胞克隆形成能力由20.83±0.76%、20.33±2.02%上升到26.83±1.26%(p0.05),而细胞的成球能力则由28.0±2.64%、23.67±2.06%上升到47.67±2.74%,具有显著的统计学意义(p0.05);(8)干扰SEMA3F的表达后可以显著增加结直肠癌细胞系HCT116的体内成瘤能力,无论是肿瘤的发生率还是肿瘤的生长速度,干扰SEMA3F的结直肠癌细胞都明显优于对照组,而当同时注射1×106个结直肠癌细胞时,干扰组的结直肠癌细胞形成的移植瘤的体积(347.872±90.66mm3、277.35±54.166 mm3 VS 1025.96±169.5mm3,p0.05)与重量(0.0299±0.029g、0.068±0.006g VS 0.4426±0.1279g,p0.05)都显著高于对照组。2.SEMA3F的表达可以使Wnt信号通路的激活受到抑制;(1)上调SEMA3F的表达后可以显著抑制结直肠癌细胞系HCT116中Wnt信号通路的活性(0.489±0.06、0.465±0.08 VS 0.15±0.005,p0.05),同时β-catenin的表达水平也被明显抑制;(2)干扰SEMA3F的表达后可以显著增加结直肠癌细胞系HCT116中Wnt信号通路的活性,荧光值由1.59±0.06、1.19±0.09增加到6.56±0.79,且具有明显的统计学意义(p0.05);(3)干扰SEMA3F的表达后可以显著增加结直肠癌细胞系HCT116中总β-catenin的表达水平,进一步检测发现,胞浆中的β-catenin无明显改变,干扰组中胞核的β-catenin的表达水平上调。3.GTP-Rac1介导了SEMA3F对结直肠癌干性特征的调控;(1)干扰SEMA3F的表达后可以显著上调基因ARHGEF7及GTPBP4的表达水平;(2)过表达结直肠癌细胞的SEMA3F表达水平后可以显著抑制基因ARHGEF7及GTPBP4的表达水平;(3)干扰SEMA3F的表达后可以显著增加结直肠癌细胞系中的GTP-Rac1激活;(4)过表达结直肠癌细胞SEMA3F的表达水平后可以显著抑制结直肠癌细胞系中GTP-Rac1的激活;(5)对于结直肠癌细胞系HCT116而言,外源性GTP-Rac1的抑制剂NSC23766的有效药物浓度为75u M,而LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2及GTP-Rac1的表达水平皆随药物浓度的增高而降低;(6)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制剂NSC23766处理干扰组及对照组细胞时,敲低SEMA3F所导致的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2上调均能被逆转;(7)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制剂NSC23766处理干扰SEMA3F及对照组结直肠癌细胞HCT116及SW480时,敲低SEMA3F所引起的细胞克隆形成能力及成球能力的上调均能被逆转;(8)用75m M外源性GTP-Rac1的抑制剂NSC23766处理过表达SEMA3F及对照组结直肠癌细胞HCT116时,SEMA3F抑制细胞克隆形成能力及成球能力的现象能得到增强;(9)用小干扰RNA处理干扰组及对照组细胞时,发现干扰SEMA3F所引起的LGR5、β-Catenin、Nanog、Oct4、Sox2的上调也能被逆转。4.人类结直肠癌标本中SEMA3F和LGR5以及GTP-Rac1的表达状况及临床意义(1)SEMA3F表达定位于正常组织黏膜上皮细胞及早期结直肠癌组织的胞浆中,随着肿瘤级别的增高而呈递减趋势,SEMA3F的表达与结直肠癌的远处转移、淋巴结转移、TNM分期及病人的复发临床病理特征显著负相关,同时SEMA3F高表达的病人其预后较好;(2)GTP-Rac1高表达于结直肠癌组织中,随着肿瘤患者TNM分期的增高而呈递增趋势,其表达水平与结直肠癌的远处转移、淋巴结转移、TNM分期及复发等病理特征呈明显正相关关系,且GTP-Rac1表达水平高的病人其预后往往较差;(3)LGR5高表达于结直肠癌肿瘤组织及肿瘤侵袭前缘,其表达水平与结直肠癌复发、肿瘤的侵润深度、淋巴结转移及TNM分期等病理特征呈明显正相关关系,而高表达LGR5的病人预后较差,通过免疫荧光及免疫组化双标,SEMA3F及LGR5的表达无明显的共定位现象,呈现“此起彼伏”的表达现象;(4)SEMA3F的表达与GTP-Rac1的表达呈明显负相关关系,SEMA3F高表达的病人其GTP-Rac1的表达水平较低,同时SEMA3FlowGTP-Rac1high病人的生存期最短,单因素及多因素分析提示联合GTP-Rac1及SEMA3F是结直肠癌独立的预后指标;本文总结如下:SEMA3F可以抑制结直肠癌细胞的自我更新能力,敲低SEMA3F的表达后,结直肠癌细胞的体内成瘤能力得到了增强;SEMA3F的表达可以抑制Wnt信号通路的活性;Rac1的激活在SEMA3F介导的干性特征抑制发挥着重要作用,并且不依赖于APC突变;SEMA3F的表达与临床病理参数成负相关,GTP-Rac1的表达与临床病理参数成正相关,与患者的生存时间正负相关,联合SEMA3F及GTP-Rac1的表达是结直肠癌患者独立的预后指标。
[Abstract]:In recent years , we have investigated the effects of SEMA3F on the cell proliferation , migration and motility of colorectal cancer cells . In recent years , we have investigated the effects of SEMA3F on the cell proliferation , migration and motility of colorectal cancer . ( 5 ) After the expression of SEMA3F , the growth rate of HCT116 in colorectal cancer cell line HCT116 decreased from 20.83 卤 2.78 % , 20.67 卤 2.06 % to 26.83 卤 1.26 % ( P < 0.05 ) . The expression level of SEMA3F and LGR5 and GTP - Rac1 were significantly correlated with the expression of SEMA3F and control group . SEMA3F can inhibit the self - renewal ability of colorectal cancer cells , and the expression of SEMA3F can inhibit the activity of Wnt signaling pathway . The expression of SEMA3F can inhibit the activity of Wnt signaling pathway .

【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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