TET2基因转染对急性髓系白血病细胞生长及17-DMAG治疗敏感性的影响及机制
发布时间：2018-01-16 10:36
本文关键词：TET2基因转染对急性髓系白血病细胞生长及17-DMAG治疗敏感性的影响及机制 出处：《安徽医科大学》2017年博士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：本研究通过三部分研究了TET2基因转染对急性髓系白血病细胞生长及17-DMAG治疗敏感性的影响及机制。第一部分我们通过回顾性分析184例急性髓系白血病患者标本TET2突变情况,并研究患者的临床特征、化疗敏感度、生存时间等,从而为AML预后分层提供一定的参考意义。第二部分通过体外培养人白血病细胞HL-60,检测17-DMAG对人白血病细胞增殖及凋亡的影响以及可能的机制。第三部分我们使用17-DMAG作用于TET2基因转载的HL-60细胞,从而明确17-DMAG与TET2在急性白血病发生发展之间的关系及机制第一部分探讨TET2基因和TET2基因突变在急性髓系白血病中的表达及其临床意义目的:分析初诊急性髓系白血病TET2基因突变发生率,评价TET2突变型及TET2野生型患者临床特征、近期疗效及远期预后。方法:回顾性分析184例初治急性髓系白血病患者采用聚合酶链式反应(PCR)检测TET2基因表达及突变,并通过直接测序的方法检测TET2与NPM1、DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA的突变状态,同时收集患者临床资料。诱导治疗主要采用标准剂量的DA、IA或地西他滨+CAG方案。比较TET2基因突变和TET2野生型患者之间临床资料的异同,评价TET2突变患者化疗疗效,及分析该基因突变表达水平与野生型患者之间的总生存率和无事件生存率的关系。结果:184例初发急性髓细胞白血病患者(非M3)标本中检测出32例发生TET2基因突变,发生率为17.39%;32例TET2基因突变患者组中男26例,女6例,中位年龄44岁(18 68岁);152例阴性患者组中男110例,女42例,中位年龄38.5岁(18~87岁)。两组年龄及性别无统计学差异(P0.05)。与TET2野生型患者相比,TET2突变患者具有以下临床特征:初诊时患者类型多为M4、M5亚型,外周血血小板较低(P=0.04);易合并DNMT3a、FLT3-ITD、CEBPA突变,(P0.05)。但在FAB亚型,外周血白血病,血红蛋白、骨髓原始细胞百分比、伴NPM1基因突变、NCCN预后危险分组方面,两组无统计学差异(P0.05)。TET2野生型152例AML患者治疗完全缓解86例(86/152,56.58%),部分缓解9例(9/152,5.92%),未缓解48例(48/152,31.58%);TET2突变组32例AML患者治疗完全缓解20例(20/32,62.5%),部分缓解4例(4/32,12.5%),未缓解8例(8/32,25%);三组差别均无统计学差异(P=0.37)。184例患者随访12-60个月,中位随访时间30个月。TET2突变组患者无病生存期(DFS)和总生存期(OS)明显短于TET2野生型组,统计学有明显差异(P0.05)结论:TET2基因在中国AML患者中的突变率与西方人群相似,TET2基因突变与AML特定生物学特征相关,突变患者其整体生存期及无病生存期明显缩短,提示该突变对成人患者的危险分级和治疗具有重要的意义。第二部分17-DMAG抑制白血病细胞增殖并诱导其凋亡目的:观察17-DMAG对白血病细胞增殖及凋亡的影响方法:1.使用MTT法及细胞克隆形成实验检测不同浓度、不同作用时间17-DMAG对白血病细胞增殖的影响。2.使用Annexin V/PI染色及合并流式细胞术检测不同浓度17-DMAG诱导白血病细胞株HL-60细胞48小时后细胞凋亡的情况。3.使用JC-1染色流式法检测17-DMAG对HL-60细胞线粒体膜电位的影响。4.使用Western blot检测17-DMAG作用白血病细胞HL-60后caspase-3、caspase-9、Bcl、Bax的表达,并与对照组比较,从而研究17-DMAG诱导白血病细胞HL-60凋亡的机制。结果:1.细胞克隆形成实验检测显示17-DMAG对于白血病细胞株HL-60生长具有抑制作用,MTT法显示17-DMAG抑制白血病细胞株HL-60细胞增殖呈时间和剂量依赖性。2.Annexin V/PI染色合并流式细胞术检测17-DMAG诱导白血病细胞株HL-60细胞凋亡结果显示:17-DMAG呈时间和剂量依赖的诱导HL-60细胞调亡。3.17-DMAG处理HL-60细胞48 h后随着17-DMAG浓度的增加红色荧光逐渐减弱,绿色荧光逐渐加强,JC-1染色结果表明17-DMAG可降低白血病细胞HL-60线粒体膜电位。4.17-DMAG处理48 h,促凋亡Bax,c-caspase-3和c-caspase-9的蛋白表达水平显着高于对照组(P0.05)上调,抗凋亡的存活蛋白survivin和Bcl-2的蛋白表达水平显着(P0.01)下调。结论:逡1.17-DMAG能够抑制HL-60细胞的增殖,随着药物浓度的增加、作用时间的延长,细胞生长抑制率有逐渐增加的趋势,证实对细胞的增殖抑制作用呈时间、剂量依赖性。2.17-DMAG能够诱导HL-60细胞凋亡。3.17-DMAG诱导HL-60细胞凋亡的机制,可能是通过凋亡线粒体途径作用,与增加caspase-9和caspase-3蛋白表达,下调Bcl-2和上调Bax蛋白表达水平有关。第三部分TET2基因能增强17-DMAG对人急性髓系白血病HL-60细胞株凋亡及对信号通路PI3k/AKT信号通路影响研究目的:研究转染TET2基因过表达对于急性急性髓系白血病HL-60细胞株增殖及凋亡的影响。探讨TET2基因联合17-DMAG对人白血病细胞HL-60细胞增殖及凋亡的作用及对信号通路PI3K/AKT影响,进而为急性髓系白血病白血病的治疗探索新思路。方法:1.将过表达TET2慢病毒载体pWPT-PURO-TET2转染至白血病HL-60细胞株,以提高白血病HL-60细胞系TET2的表达。为了分析重组慢病毒载体是否成功的转染HL-60细胞,在感染后第3天通过荧光显微镜观察是否有GFP+的HL-60细胞及阳性细胞的比例,并用Western blot法检测TET2蛋白的表达情况。2.通过MTT法检测白血病细胞HL-60转染TET2前后细胞生长曲线变化。3.使用Annexin V/PI双染的方法通过流式细胞仪测定转染前后白血病细胞的凋亡情况。4.MTT法检测17-DMAG药物作用于TET2转染后白血病细胞株HL-60细胞增殖及抑制的作用。5.使用Annexin V/PI染色合并流式细胞术检测TET2过表达增强白血病HL-60细胞对17-DMAG的治疗敏感性。6.使用western blot方法检测17-DMAG对TET2转染后白血病细胞株HL-60PI3K/Akt信号通路的影响。结果:1.荧光显微镜检查显示慢病毒pWPT-PURO-GFP-TET2转染的人白血病HL-60细胞系,超过80%的细胞是GFP+。Western blot法检测TET2蛋白的表达情况,检测结果示,转染过表达TET2质粒的白血病HL-60细胞系TET2蛋白表达远大于空载体转染组。2.MTT法结果表明转染组较转染空载体组细胞生长明显减慢(P0.05)。3.使用Annexin V/PI双染的方法通过流式细胞仪测定白血病细胞凋亡结果显示:转染过表达TET2载体的白血病HL-60细胞系凋亡明显增加(P0.05)。4.17-DMAG作用于转染过表达TET2载体的白血病HL-60细胞后,MTT法结果显示转染TET2基因,或是加入1.6μmol·L17-DMAG,都能够明显抑制HL-60细胞增殖率,尤以转染TET2联合17-DMAG对细胞增殖的抑制作用最强(P0.05)。5.Western blot检测表明17-DMAG作用于转染过表达TET2的HL-60细胞后,TET2蛋白在白血病细胞HL-60中表达明显增强,差异有统计学意义(P0.05)。6.流式细胞术结果显示TET2基因过表达可以增强17-DMAG诱导白血病HL-60细胞凋亡。7.17-DMAG通过抑制PI-3K/Akt信号通路促进HL-60白血病细胞凋亡,主要是通过信号通路中Bax、caspase-3、caspase-3表达增强,Bcl-2、survivin表达下降实现的。结论:1.TET2过表达可以引起白血病细胞HL-60生长减慢,凋亡增多,可能为白血病的一种抑癌基因。2.TET2能协同17-DMAG促进HL-60细胞的凋亡,抑制细胞的增殖。3.TET2协同17-DMAG对HL-60细胞的生长的影响是通过PI3k/AKT信号通路实现的。
[Abstract]:鏈爺绌堕，
本文编号：1432742
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