MMI-0100通过对心肌细胞及成纤维细胞中MK2的抑制作用降低心肌纤维化程度的研究

发布时间：2018-01-20 06:08

本文关键词： 细胞凋亡心肌缺血心肌细胞成纤维细胞心肌纤维化丝裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶2 MK2 MMI-0100 细胞坏死　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景及目的缺血性心脏疾病是目前世界上最常见的致死性疾病；在美国,每年有约785000个人发生心肌梗死,几乎每分钟一个人。而梗死后心肌的不可逆重塑是导致梗死后心功能不全乃至心衰的主要原因。虽然介入治疗-大多数是早期的再灌注治疗-可以增加患者的生存率,但是导致心功能衰竭的心肌不可逆重塑过程却无法停止。梗死区域的大小,梗死部位的恢复以及慢性的左心室重塑决定了最终心力衰竭的程度。为了使梗死后的心力衰竭的程度最小化,在梗死后的早期对梗死区域进行缩小的治疗方案显得尤为重要。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAP激酶,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一,在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。在哺乳动物机体中,已经发现五种不同的MAPK信号转导通路。其中ERKl/2信号转导通路调控细胞生长和分化,JNK和p38 MAPK信号转导通路在炎症与细胞凋亡等应激反应中发挥重要作用。目前已知的是,p38MAPK在致死性的心肌梗死过程中与心肌细胞的死亡,心肌梗死后的心力衰竭、心肌纤维化程度及心肌细胞的肥大密切相关；而丝裂原激活的蛋白激酶激活的蛋白激酶2 (MAPKAPK2或者MK2),作为p38 MAPK在细胞内的下游丝氨酸／苏氨酸激酶的底物,也在很多炎性疾病导致的瘢痕形成及纤维化过程中有涉及。近期关于MK2-/-小鼠的研究证实了MK2在p38 MAPK通路中的重要作用,并且同时验证了其与p38诱导的心力衰竭密切相关。此外,MK2-/-小鼠还可以抵抗缺血再灌注的损伤,这些都提示了在缺血性心脏疾病过程中MK2信号通路的重要性。近期的研究报道了一种细胞浸透性的短肽MMI-0100在一个小鼠静脉移植模型中可以抑制术后炎症反应以及纤维化(内膜增生),在一个猪的博来霉素诱导肺纤维化模型中可以减轻肺的纤维化程度,在一个腹部手术模型中可以减轻粘连。因此,我们决定对小鼠急性心肌梗死后通过应用MMI-0100抑制MK2信号通路发挥心肌保护作用的假说进行实验。基于先前的研究成果,我们的研究对MMI-0100在小鼠体内心肌梗死后降低纤维化范围的假说进行了体内试验。我们证实了在标准的冠状动脉左前降支(LAD)结扎诱导的鼠类心肌梗死模型中MMI-0100在梗死后2周的时间点上降低了心肌纤维化程度。已知MK2信号通路在心肌细胞死亡、成纤维细胞分化以及细胞外基质(其中包括胶原)的分泌(导致纤维化)过程中发挥重要作用,我们通过体外细胞实验证实了MMI-0100在是通过对心肌细胞和心肌成纤维细胞两种不同的细胞分别发挥作用来实现的心肌保护作用。我们发现在体外实验中,MMI-0100在两种心肌来源的心肌细胞(H9C2.HL-1)中可以抑制caspase3/7的活性,而在心肌成纤维细胞中却能够增强caspase3/7的活性。这些研究结果首次报告了MMI-0100能够抑制心肌梗死后的心肌纤维化,同时还阐明了其通过抑制MK2活性进而抑制心肌细胞的凋亡的原理,而且还发现了其通过对于心肌成纤维细胞的直接作用达到减轻心肌纤维化的目的。方法1.动物实验：(1)我们采用了C57BL/6雄性小鼠的心肌梗死模型进行实验,心肌梗死模型是通过永久性地结扎冠状动脉左前降支获得。我们将小鼠分5组进行实验：1.心肌梗死组：永久性结扎冠状动脉前降支但无MMI-0100注射；2.心肌梗死后治疗组：永久结扎冠状动脉前降支后1小时内,经腹膜腔注射MMI-0100,并每日重复注射14天(50μg/kg/day)；3.假手术组：假手术组除了不对冠状动脉进行结扎外,其他手术步骤完全相同;4.正常对照组：未行手术及药物注射；5.单纯药物注射组：未行手术但每日重复注射MMI-0100(50μg/kg/day)14天。期间对小鼠的心功能(LVEDD;LVESD;LV Vol:d；LV Vol;s;FS;EF%等指标)进行测定分析,共分三个测量时间点：基点,7天和14天。(2)动物实验标本的免疫组织化学分析：在实验终点处死小鼠,获取小鼠心脏标本并进行石蜡包埋,切片,应用HE染色及Masson's trichrome (MT)染色进行心肌纤维化程度的分析；对组织切片进行vimentin, α-SMA, TGF-β1及TUNEL荧光染色以确定组织中不同细胞组成的改变及对细胞凋亡程度进行测定。2.细胞实验：(1)原代心肌成纤维细胞及心肌细胞系的培养我们采用H9C2,HL-1两种心肌细胞系及原代培养的大鼠心肌成纤维细胞进行实验,培养方法严格按照已经发表的操作步骤进行。(2)缺氧环境的获得、缺氧时间点的确定以及细胞死亡率的确定。缺氧环境通过将细胞置入一个缺氧培养箱(使用混合的5%CO2及95%N2提供一个1%氧浓度的缺氧环境)。每种细胞分3个实验组：1)0.5%DMSO终浓度组；2) 20μM MMI-0100[溶于终浓度为0.5%的DMSO]组；3) 100μM MMI-0100[溶于终浓度为0.5%的DMSO]组,并取3个实验时间点。这些时间点根据在缺氧环境中细胞的LDH释放量确定的细胞死亡程度进行选择：H9C2细胞系：8小时；16小时；24小时；HL-1细胞系：4小时；8小时；12小时；心肌成纤维细胞系：16小时；32小时；48小时。(3)细胞死亡及凋亡的分析使用LDH释放量测定试剂盒对细胞培养液中的LDH进行测定以确定细胞的死亡率；使用Caspase3/7活性检测试剂盒对细胞裂解液中Caspase3/7的活性进行测定以确定细胞的凋亡率。(4)MK2活性的免疫印迹分析我们采用了hnRNPAO,MAPK2以及phospho-MAPK2三个指标来对MK2的活性进行分析；(5)细胞培养基中TNF α,IL-1β及IL-6细胞因子的分析。我们对细胞进行处理后的培养基中的TNF α,IL-1β及IL-6等细胞因子进行了定量分析。结果1.急性心肌梗死后体内应用MMI-0100短肽治疗可保护心功能并减轻心室扩张。实验证实：心肌梗死组的左室射血分数(EF%)较假手术对照组减少了26%,左室短轴缩短率(FS%)减少了37%。而MMI-0100治疗组则将这两项指标的降低分别减少到了12%和20%。MMI-0100还相应地缓解了心梗后典型的左心室容积及其舒张末直径的增加。而单纯MMI-0100治疗的对照组显示其对正常小鼠的心功能和生存率无影响。2.急性心肌梗死后体内应用MMI-0100治疗可以通过减少心肌细胞的死亡,同时增加成纤维细胞的死亡来减轻心肌纤维化。(1)动物实验中,对实验小鼠的梗死后心肌组织切片进行Masson's trichrome染色的结果证实急性心肌梗死后接受MMI-0100治疗的实验组心肌纤维化程度较非治疗组减少了50%。而且我们在对各组中的有代表性的组织切片进行详尽观察时还发现,MMI-0100治疗组切片在相同层面上的切片中的梗死区要小,而且在梗死区内部可见到有小的存活的心肌细胞岛。而对组织切片的免疫荧光染色显示,MMI-0100治疗在心梗后可以减少成纤维细胞的数量,增加动脉密度并且减少了组织切片中TGF-β阳性的细胞。这一点证实MMI-0100可能是通过抑制TGF-β的作用(通过MK2的抑制作用)来实现其降低非梗死区心肌纤维化程度,从而发挥保护心功能的作用的。(2)细胞实验中,心肌细胞来源的H9C2细胞系及HL-1细胞系在低氧处理后caspase3/7的活性都有相应地增强,但在MMI-0100的作用下,这个预示着细胞凋亡信号的指标却得到了有效的抑制；而原代培养的大鼠心肌成纤维细胞实验中,MMI-0100却显著增强了caspase3/7的活性。而对细胞裂解液中蛋白表达的分析显示：在H9C2细胞及HL-1细胞中,MMI-0100在缺氧处理后明显抑制了hnRNPAO的表达,然而MK2及p-MK2的表达水平都没有明显的改变;而大鼠心肌成纤维细胞中,MMI-0100没有抑制hnRNPAO的表达,MK2及p-MK2的蛋白水平也没有明显的改变。而这些研究结果说明MMI-0100在低氧环境下能够抑制心肌细胞的凋亡,而同时促进成纤维细胞的死亡,这或许能够说明MMI-0100在体内实验中是通过降低了成纤维细胞的活性从而减轻心肌纤维化程度的。结论使用合理设计的细胞浸透性短肽MMI-0100通过抑制丝裂原活化的蛋白激酶活化的蛋白激酶Ⅱ(MK2)的活性能够在2周后抑制急性心肌梗死后心肌纤维化程度并保护心脏功能,其机制牵涉了对心肌细胞凋亡的抑制,同时还增加了原代心肌成纤维细胞的死亡。
[Abstract]:Background and Objective Ischemic heart disease is one of the most common fatal diseases in the world . In the United States , there are about 785,000 individuals with myocardial infarction , almost one person per minute . 3 . sham operation group : Except for coronary artery ligation , other surgical procedures were the same ; 4 . Normal control group : no procedure and drug injection ; 5 . Analysis of myocardial fibrosis degree in rats with normal control group : no procedure but repeated injection of MMI - 100 ( 50 渭g / kg / day ) for 14 days . ( 2 ) The cell death and apoptosis were determined by using the serum LDH release assay kit . The results showed that the cell death rate was reduced to 12 % and 20 % . The results showed that the expression of Caspase 3 / 7 in the cells was reduced by 26 % and the decrease of the left ventricular end shortening ( FS % ) was reduced by 37 % . In vivo experiments , the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited in the experimental group , but the expression level of caspase - 3 / 7 was significantly inhibited by the action of MMI - 100 . The mechanism involved the inhibition of myocardial fibrosis and the death of the primary myocardial fibroblasts .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22

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