鹿茸蛋白修复缺血缺氧诱导的心肌细胞及心脏微血管损伤的机制研究

发布时间：2018-01-21 20:06

本文关键词： 鹿茸内皮祖细胞缺血缺氧心脏微血管内皮细胞心肌细胞 Akt Notch　出处：《北京中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的:课题组前期已证实,鹿茸能够提高心梗后心衰大鼠的心功能,降低心脏基质胶原纤维化、延缓心室重塑,调节SERCA2a表达活性,改善心肌收缩舒张功能;此外,鹿茸蛋白提取物能够促进HUVECs的增殖。本研究拟对鹿茸蛋白进行蛋白质组学分析,依据缺血性心脏病发病机制,体外构建缺血缺氧细胞模型,明确鹿茸蛋白对缺血缺氧损伤的心脏微血管内皮细胞和心肌细胞的修复作用,同时观察鹿茸蛋白对内皮祖细胞的调控作用,于前期研究结果的基础上,进一步挖掘鹿茸改善心梗后心功能的作用机制——鹿茸蛋白通过保护受损的心脏微血管内皮细胞,同时影响内皮祖细胞活力,进而修复心脏微血管的损伤;鹿茸蛋白直接保护损伤的心肌细胞,减少心肌细胞凋亡。研究方法:(1)鹿茸蛋白质组学分析:应用预冷冻结合冷冻干燥技术、以水为溶剂,超声波辅助匀浆法提取鹿茸蛋白,纳升级液相色谱串联质谱(Nano-LC-MS/MS)检测鹿茸蛋白的成分,并进行GO功能注释和KEGG分析。(2)鹿茸蛋白对CMECs缺血缺氧损伤的干预作用:细胞分离与鉴定应用组织酶消化法,差速贴壁原代分离培养SD大鼠乳鼠心脏微血管内皮细胞(Cardiac Microvascular Endothelial Cells,CMECs),CD31和vWF抗体免疫荧光鉴定原代CMECs。实验分组实验分为对照组、模型组和不同浓度鹿茸蛋白干预组。对照组于37°C,5%C02条件下用ECM完全培养基培养,模型组给予无血清DMEM/F-12培养基,阳性对照组为完全DMEM/F-12 培养基,鹿茸蛋白干预组分别给于 0.25mg/ml、0.5 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml浓度鹿茸蛋白无血清DMEM/F-12培养基,使用细胞缺氧制备装置对模型组、阳性对照组及各鹿茸蛋白干预组进行缺血缺氧(Ischemia and hypoxia,IH)处理46小时。检测指标应用MTS试剂盒检测CMECs的活性,EdU试剂盒检测CMECs的DNA活性,Matrigel胶检测细胞成管能力,划痕实验和transwell小时检测CMECs的迁移能力;AV-PI试剂盒流式细胞术检测CMECs的凋亡情况,JC-1试剂盒流式细胞术检测CMECs线粒体膜电位的变化,Western Blot检测CMECs相关蛋白的表达水平。(3)鹿茸蛋白对CMs缺血缺氧损伤的干预作用:细胞分离与鉴定应用组织酶消化法,原代分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs),应用MHC抗体进行免疫荧光鉴定CMs。实验分组分组及干预方法同(2),对细胞活性进行检测后,保留对照组、模型组、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白干预组,经条件摸索得到缺血缺氧处理时长为36小时。检测指标CMs的DNA活性、凋亡情况、线粒体膜电位变化及相关信号通路关键因子表达水平检测方法同(2),镜下观察记录CMs收缩情况。(4)鹿茸蛋白对EPCs细胞活性的影响:细胞分离与鉴定应用密度梯度离心法从体重130g左右SD大鼠股骨和胫骨中原代分离培养内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs),应用CD133、VEGFR2抗体免疫荧光鉴定EPCs。实验分组实验分为对照组和鹿茸蛋白干预组,对照组由EGM-2完全培养基培养,鹿茸蛋白干预组给予0.0625mg/ml、0.25mg/ml、lmg/ml浓度鹿茸蛋白培养基。检测指标检测EPCs的活性、成管能力、迁移能力和细胞内主要信号通路关键因子的表达水平,检测方法同(2)。研究结果:(1)鹿茸蛋白粗提物的质量浓度为465.56 IMg/mg,质谱检测鉴定到总蛋白386个,有145个未定性蛋白成分。386个蛋白的分子量分布于6.298到829.008kDa之间,74.4%的蛋白分子量位于1OkDa到20kDa之间,其次是1OOkDa到200kDa之间(12.8%)。等电点的分布在4.14到11.57之间,大部分的蛋白分布在4.0到7.0之间(68.4%)和8.0到9.0之间(12.8%)。鹿茸蛋白细胞组成分析结果显示,130(33.7%)个蛋白质位于细胞膜上,111(28.8%)个蛋白位于细胞基质内,52(13.5%)个蛋白是细胞骨架组成成分,54(14%)个蛋白位于细胞核,39(10%)个蛋白属于细胞外基质中的蛋白成分,14(3.6%)个蛋白是高尔基体的组成成分,12(3%)个蛋白位于内质网上,12(3%)个蛋白位于线粒体中,9(2%)个蛋白属于核糖体成分;生物过程分析结果显示,211个蛋白参与生物代谢过程,102个蛋白在代谢调节中发挥作用,151个蛋白参与了生物学过程中对外界刺激的反应和交互作用,110个蛋白参与了定位相关的生物学过程,14个蛋白参与了增长相关的生物学过程。此外,分析得出64个蛋白与细胞信号通路相关,其中40个蛋白参与信号的调控过程;38个蛋白参与了细胞的凋亡,27个蛋白与细胞的迁移能力相关;分子功能分析结果显示,共有323个蛋白参与,其中228个蛋白与绑定(binding)过程相关,部分与分子功能中的蛋白重复,大部分属于绑定功能的蛋白负责离子束缚,核苷酸、核糖核苷酸结合绑定过程。负责分子功能调节作用的有53个蛋白,另夕外,参与催化活性(catalytic activity)的有121个,参与调节酶活性(enzyme regulator activity)的有49个蛋白,参与运输活动(transferase activity)的有28个蛋白。(2)鹿茸蛋白对CMECs缺血缺氧损伤的作用研究结果显示,缺血缺氧处理后,CMECs的活力、DNA活性,线粒体膜电位、迁移能力和成管能力均降低;与模型组比较,鹿茸蛋白干预后CMECs的活力、DNA活性、线粒体膜电位、迁移能力和成管能力显著升高,以0.5和1 mg/ml剂量组效果最优;缺血缺氧造成CMECs凋亡,鹿茸蛋白干预后,CMECs的凋亡率降低,以0.5、1、2mg/ml的鹿茸蛋白效果最为显著;Western Blot结果显示,缺血缺氧后,CMECs的Bcl-2和p-Akt表达水平下降,Bax和cleaved-caspase3的水平升高;鹿茸蛋白的干预改变了上述蛋白的变化趋势,使Bcl-2和p-Akt的表达上调,并使Bax和cleaved-caspase3水平下降;应用LY294002后,鹿茸蛋白对上述各因子的作用被抑制。(3)鹿茸蛋白对CMs缺血缺氧损伤的作用研究结果显示,缺血缺氧处理后,CMs的活力、DNA活性,线粒体膜电位和跳动次数均下降,鹿茸蛋白干预后,CMs的活力、DNA活性、线粒体膜电位显著升高,以1mg/ml剂量组效果最优,鹿茸蛋白对CMs跳动的影响与模型组比较无统计学差异;缺血缺氧造成CMs凋亡,鹿茸蛋白干预后凋亡细胞的数量下降,0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml鹿茸蛋白组间比较无统计学差异;WesternBlot结果显示,缺血缺氧造成CMs的Bax和cleaved-caspase3蛋白表达水平升高,p-Akt和Bcl-2的表达水平下降,鹿茸蛋白干预后扭转了上述蛋白的变化趋势,Bax和cleaved-caspase3表达被抑制,p-Akt和Bcl-2表达水平上调;向细胞培养基中加入LY294002,鹿茸蛋白上述作用减弱。(4)鹿茸蛋白对EPCs活性的影响研究结果显示,0.25mg/ml和1mg/ml的鹿茸蛋白在24小时、36小时和48小时观察时间点均显著促进EPCs的活性,但对EPCs的成管能力无明显影响;lmg/m1鹿茸蛋白明显促进EPCs的迁移能力,但0.0625mg/ml和0.25.g/ml鹿茸蛋白对EPCs的迁移能力无明显影响;WestemBlot结果显示,鹿茸蛋白呈一定浓度依赖性地增加EPCs的NICD表达水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白组Hes1的活化水平亦显著增加,加入DAPT后,鹿茸蛋白对NICD和Hes1的作用消失;此外,与对照组比较,鹿茸蛋白呈一定浓度依赖性地增加Akt的磷酸化水平,0.25mg/ml和1mg/ml鹿茸蛋白组mTOR的磷酸化水平亦显著增加,加入LY294002后,Akt和mTOR的磷酸化水平均下降。研究结论:1.鹿茸蛋白组成复杂,是含有丰富的具有多样分子功能、参与多种生物过程的蛋白质混合物。2.鹿茸蛋白能够降低缺血缺氧造成的CMECs、CMs损伤,通过调节PI3K/Akt信号通路影响凋亡相关细胞因子Bcl-2、Bax和caspase3的表达,达到对缺血缺氧情况下CMs和CMECs的保护作用。3.鹿茸蛋白对EPCs的增殖和迁移能力有一定促进作用,同时增加细胞Notch1信号通路相关蛋白Notch1和Hes1的活化及Akt/mTOR信号通路上的Akt和mTOR的磷酸化水平。研究意义:1.课题组前期已证实,鹿茸能够改善心梗后的心功能,提高射血分数,减缓心室重塑。本研究为上述结果提供了更深一层的理论支持,研究结论提示,鹿茸蛋白可能通过保护受损的心脏微血管内皮细胞,同时影响内皮祖细胞的活力,调节二者的增殖、迁移和成管能力,进而促进损伤心脏血管的修复和再生过程;此外,鹿茸蛋白能够直接降低心肌细胞的凋亡率,保护受损的心肌组织。2.课题组对鹿茸展开多项相关研究,旨在系统挖掘鹿茸在心血管疾病治疗中的药理作用,为缺血性心脏病的治疗提供新的思路和方法;同时以期规范鹿茸制药的使用,为人工合成药物减少鹿茸的采摘和使用量提供实验依据。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

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