基于TGF-β1探究口服常山酮对骨性关节炎的作用及其机制

发布时间：2018-01-23 23:13

本文关键词： 骨性关节炎关节软骨软骨下骨 TGF-β1 常山酮　出处：《新疆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:基于TGF-β1探究口服常山酮对骨性关节炎的作用及其机制:1)通过分析人膝关节胫骨平台中关节软骨完整与关节软骨部分磨损标本处关节软骨与软骨下骨中TGF-β1表达量,初步探究TGF-β1在骨性关节炎中可能的作用;2)通过建立小鼠ACLT关节炎模型,采用口服方式给予常山酮干预,分别从软骨及软骨下骨角度探讨常山酮对骨性关节炎的作用及TGF-β1所扮演的角色。方法:1)在人膝关节胫骨平台标本,通过大体观察分别选择关节软骨完整及关节软骨部分磨损两处标本,使用番红固绿染色,OARSI-Modified Manking评分及免疫组化检测MMP-13在关节软骨中的表达量,验证两处标本中关节软骨的状态。通过micro-CT对比两处标本中软骨下骨的微观结构,采用免疫组化分别对比两处标本软骨及软骨下骨中TGF-β1的表达量;2)通过急性毒理试验,使用Bliss法计算常山酮的半数致死量,摸索给药剂量。将3月大C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组,ALCT安慰剂组及ACLT常山酮治疗组,ACLT安慰剂组通过口服灌胃方式隔日给予蒸馏水,ACLT常山酮治疗组通过口服灌胃方式隔日给予对应剂量的常山酮,持续30天。术后30天及60天处死小鼠。采用番红固绿染色及OARSI-Modified Manking评分评价小鼠关节软骨破坏情况,通过HE染色观察透明软骨层及钙化软骨层的厚度,潮线位置是否改变。采用免疫荧光分析小鼠关节软骨中MMP-13,Col X,TGF-β1及p-Smad2/3的表达量。用1%ITS诱导ATDC5细胞,使用阿尔新蓝染色及RT-PCR鉴定诱导后ATDC5细胞成软骨细胞。CCK-8检测常山酮对软骨细胞的毒性,WB检测常山酮对软骨细胞TGF-β1信号通路的影响;3)将3月大C57BL/6雄性小鼠随机分为假手术组,ALCT安慰剂组及ACLT常山酮(0.25mg/kg)治疗组,ACLT安慰剂组通过口服灌胃方式隔日给予蒸馏水,ACLT常山酮治疗组通过口服灌胃方式隔日给予常山酮,术后30天及60天处死小鼠。通过Micro-CT分析小鼠软骨下骨微观结构,基于Micro-CT血管造影检测小鼠软骨下骨血管情况。TRAP染色观察软骨下骨破骨情况,免疫组化分析软骨下骨中Osterix,p-Smad2/3及CD31表达量。结果:1)番红固绿染色及OARSI-Modified Manking评分显示肉眼观关节软骨部分磨损标本的软骨破坏程度较肉眼观关节软骨完整标本更重(p0.01)。免疫组化显示,相比于关节软骨完整的标本,MMP-13,tgf-β1及p-smad2/3在关节软骨部分磨损标本的关节软骨中表达量更高,p-smad2/3在关节软骨部分磨损标本的软骨下骨中表达量更高(p0.01)。micro-ct显示,与关节软骨完整标本相比,软骨部分磨损标本的软骨下骨骨体积分数,软骨下骨板厚度更高,骨小梁模式因子更低(p0.01)。2)常山酮在c57bl/6雄性小鼠中的半数致死量为3.7514mg/kg,选择0.5,0.25及0.1mg/kg作为高、中、低剂量。番红固绿染色及oarsi-modifiedmanking评分显示,相较于假手术组,aclt安慰剂组关节软骨破坏程度更重,常山酮治疗组关节软骨受到保护(p0.05),但常山酮不同剂量组之间关节软骨破坏程度无明显差异(p0.05)。he染色结果显示,术后1月时,各组间透明软骨层厚度及钙化软骨层厚度无明显区别(p0.05),术后2月时,与假手术组及常山酮治疗组相比,aclt安慰剂组透明软骨层厚度减小,钙化软骨层厚度增加,潮线上移(p0.01)。术后1月及2月,常山酮不同剂量组间透明软骨层厚度及钙化软骨层厚度无明显差异(p0.05)。免疫荧光结果显示,术后1月时,与假手术组相比,alct安慰剂组关节软骨中mmp-13,colx,tgf-β1及p-smad2/3表达量更高,常山酮治疗后可以抑制这一现象(p0.05)。阿尔新蓝染色显示,atdc5细胞在1%its诱导下,随着诱导时间的逐渐增加,染色程度逐渐加深。rt-pcr结果显示,ii型胶原的表达量随着诱导时间的延长逐渐增加,诱导14d时其表达量达到峰值,诱导14d至21d时其含量逐渐减少,x型胶原的表达量随着诱导时间的延长也呈逐渐增加的趋势,诱导14d时,x型胶原的表达量逐渐接近ii型胶原的表达量,并在21d时超过其表达量。cck-8结果显示,常山酮对软骨细胞毒性呈现浓度依赖性和时间依赖性,当其浓度大于50ng/ml时,细胞存活率将低于75%。westernblot显示,常山酮可以抑制软骨细胞中tgf-β1信号通路,其作用呈现浓度依赖性和时间依赖性。3)micro-ct显示,术后1月及2月时,与假手术组相比,aclt安慰剂组小鼠软骨下骨总体积及骨小梁模式因子增加,骨体积分数及软骨下骨板的厚度减小,常山酮治疗后可以抑制软骨下骨微观结构的异常改变(p0.05)。术后1月时,trap染色结果显示,与假手术组相比,aclt安慰剂组软骨下骨破骨更加活跃,常山酮治疗后可以抑制异常活跃的破骨(p0.05)。免疫组化结果显示,与假手术组相比,aclt安慰剂组软骨下骨中osterix阳性细胞数更多,且主要分布于骨髓中(p0.01)。与假手术组相比,常山酮治疗组软骨下骨中osterix阳性细胞数无明显差异,细胞分布于骨的表面(p0.05)。与假手术组和常山酮治疗组相比,安慰剂组软骨下骨中p-smad2/3阳性细胞数更多(p0.01),而常山酮治疗组与假手术组相比无明显差异(p0.05)。基于micro-ct血管造影结果显示,术后1月时,与假手术组相比,aclt安慰剂组软骨下骨血管数量及体积均有所增加(p0.05),常山酮治疗组与假手术组相比无明显差异(p0.05)。免疫组化结果显示,术后1月时,与假手术组相比,aclt安慰剂组软骨下骨中cd31表达量更高,(p0.01),常山酮治疗组与假手术组相比无明显差异(p0.05)。结论:1)在人膝关节胫骨平台标本中,关节软骨破坏时,软骨下骨微观结构异常改变,软骨及软骨下骨中TGF-β1含量增加;2)切断成年雄性C57BL/6小鼠前交叉韧带可成功建立骨性关节炎模型,与假手术组相比,切断小鼠前交叉韧带后,膝关节稳定性受到破坏,作用于膝关节的力发生了异常改变,关节软骨内转化生长因子β1表达量异常增加,引起基质金属蛋白酶的表达增加,引起II型胶原的降解,使关节软骨发生退变。通过口服灌胃方式给予常山酮治疗时,关节软骨中异常升高的转化生长因子β1活性得到抑制,延缓了关节炎的进展,关节软骨得到保护;3)建立小鼠ACLT关节炎模型后,通过口服灌胃方式给予常山酮干预时,抑制了小鼠胫骨平台软骨下骨中异常活跃的骨吸收,异常升高的转化生长因子β1活性得到抑制,骨吸收及骨形成得到偶联,异常活跃的骨重塑受到抑制,同时,异常新生血管的形成也得到抑制,稳定了软骨下骨的微观结构,对关节软骨起到保护作用。
[Abstract]:Objective : To investigate the role of TGF - 尾1 in articular cartilage and to investigate the role of TGF - 尾1 in articular cartilage . Compared with the sham operation group , the thickness of the articular cartilage and the thickness of the calcified cartilage were higher than those in the sham operation group .

【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R684.3

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