慢性肾衰竭情况下胆汁酸代谢的临床及实验研究

发布时间：2018-01-28 03:11

本文关键词： 慢性肾衰竭胆汁酸转运蛋白肝脏肾脏肾小球滤过率　出处：《山东大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的：胆汁酸是肝脏合成的对食物中脂肪及脂溶性维生素的乳化、消化、吸收起重要作用的物质。除了小部分的胆汁酸随粪便排出体外从而丢失,大部分进入肠道的胆汁酸会在回肠被主动吸收进入门脉系统。门静脉内的胆汁酸会被肝脏重新摄取,完成肠肝循环。肝脏合成的胆汁酸主要用来补充粪便途径丢失,胆汁酸肠肝循环在转录水平对胆汁酸从头合成途径起重要调节作用。通常认为,除了胆汁淤积等一些特殊情况下,肾脏对胆汁酸的滤过、重吸收及分泌作用对胆汁酸的代谢及平衡几乎没有影响。在健康人群中,胆汁酸通过肾脏途径的代谢量可以忽略不计。肾脏主要作用是排出代谢产物、维持体内水及电解质平衡、调节血脂代谢、调节血压、分泌及降解激素、产生和利用体循环中葡萄糖,因此肾脏在维持体内内环境稳定中起到重要作用。随着慢性肾脏病进行性、慢性进展,肾单位逐渐减少,肾功能不可逆下降,继而出现代谢产物和毒物滞留,水电解质和酸碱平衡紊乱以及内分泌失调,最终导致慢性肾衰竭。然而近年来的研究表明,当肾脏功能受到损害时,不仅会出现以上所述高血压、碳水化合物及脂肪代谢紊乱等常见的表现,还会导致血浆胆汁酸水平增高及胆汁酸代谢紊乱。为了找到肾衰竭环境下血浆胆汁酸水平增高及胆汁酸代谢紊乱的原因,人们已经进行了许多动物实验研究。现有的研究结果表明,肾衰竭动物模型中的肝脏胆汁酸合成限速酶—胆固醇7α-羟化酶活性与正常对照组无明显变化,进一步实验证明在肾衰竭动物模型中,肝脏胆汁酸合成速度无明显变化。然而以上研究只是证明在肾衰竭动物模型中胆汁酸从头合成途径未受到影响,没有测定胆汁酸转运蛋白的表达,也缺乏临床相关研究资料,因此没有找到血浆胆汁酸水平增高及胆汁酸代谢紊乱的真正原因。本研究的目的就是找出肾衰竭环境下可能影响胆汁酸代谢的因素。另外本研究是首次从动物模型及临床两个方面对肾衰竭条件下胆汁酸代谢情况进行系统研究。材料和方法：1.动物模型适应性喂养一周后采用完全随机化方法进行分组。首先将动物按照体重大小编号,从随机数字表中任一行开始抄取48个随机数字,如遇相同数字,抄取下一个随机数字。对随机数字按照从小到大排序,排序后规定前16个为肾衰竭组,后16个为假手术组,中间16个为单侧肾切除组。采用文献中介绍的手术方法制作肾衰竭、单侧肾切除及假手术组模型。肾衰竭组实施5/6肾切除,首先切除2/3左侧肾组织,1周后切除整个右肾。单侧肾切除组第一次手术时仅分离肾脏包膜,假手术组大鼠两次手术都仅分离肾脏包膜。所有大鼠术后应用青霉素预防感染。所用动物在禁食过夜条件下采眼底静脉血4次,分别为手术开始前1天,手术实施后2周、4周、6周,实验8周处死动物时心脏穿刺取血。得到血浆后-80℃冻存。实验8周时处死动物,无菌手术打开腹腔,摘除肝脏、肾脏、回肠备用。分别于手术开始前及大鼠处死前24小时将大鼠置入代谢笼中,收集24小时尿液,-80℃冰箱冻存。2.动物生化指标检测血浆总胆固醇及肌酐水平采用自动生化仪测量。血浆总胆汁酸采用生化试剂盒测量。结合胆汁酸及游离胆汁酸测定采用高效液相色谱-串联质谱法。尿蛋白浓度测定采用生化试剂盒测量。3.分离培养近端肾小管上皮细胞及FXR信号通路检测将从肾组织中得到的近端肾小管上皮细胞在DMEM细胞培养液中做原代培养,向培养成功的细胞中加入FXR基因激动剂,通过RT-PCR及蛋白质免疫印迹方法检测FXR信号通路完整性。4. RT-PCR及蛋白质免疫印迹方法检测组织中各种胆汁酸代谢相关蛋白及相关基因表达情况检测项目有：大鼠肝脏胆汁酸合成限速酶Cy8b1及Cyp7almRNA水平；大鼠肝脏Cyp7a1蛋白表达；大鼠肝脏Bsep, Ntcp, Skoa1, Mrp3, Mrp4, Ost-α,Fxr以及Shp mRNA水平；大鼠肝脏Bsep, Ntcp, Slcoal, Mrp2, Mrp3以及Ost-α蛋白质表达；大鼠肾脏ASBT, Slcoal, Mrp3, Mrp4, Ost-α, Ost-β, Fxr以及Shp mRNA水平；大鼠肾脏Asbt, Mrp3以及Ost-α蛋白质表达；大鼠回肠ASBT, Mrp3, Ost-α, Ost-β mRNA水平；大鼠回肠ASBT, Mrp3, Ost-α蛋白质表达；人类肾脏ASBT, Mrp2, Ost-α, Ost-β mRNA水平；人类肾脏ASBT, Mrp2, Ost-α蛋白质表达。5.临床资料的收集共收集了两组病例资料。一组均为肾衰竭患者,61例,将34例患有良恶性肿瘤,需要接受单侧肾切除患者纳入对照组。所有对照组患者在手术前完成了血液及尿液样本收集。肾衰竭组的肾脏组织标本来源于肾脏穿刺活检,对照组标本来源于切除肾脏组织,选取远离肿瘤部位肾皮质取材。6.血液标本及尿液标本生化指标测定采用日立7600全自动生化仪测量谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、血糖、胆固醇、甘油三酯等生化指标。第五代循环酶速率法测定血液及尿液标本中总胆汁酸浓度。7.肾脏组织病理检查病理标本进行常规切片,分别常规进行HE、MASSON染色。结果：1.大鼠生化指标改变与假手术组相比,慢性肾衰竭大鼠血浆肌酐浓度明显升高,计算肾小球率过滤明显降低,表明模型建造成功。除此之外,与假手术组相比,肾衰竭组表现出轻度的蛋白尿,胆固醇浓度明显升高。与此同时,肾衰竭动物组血浆总胆汁酸水平明显升高。在高效液相色谱-串联质谱法中的到的数据可以看出,每一种胆汁酸几乎都有两倍以上的升高,比如CA,CDCA, MCA, HDCA,尤其是非结合胆汁酸更为明显。而6-羟基胆汁酸,比如MCA和HDCA的比率和假手术组无明显差异。2.肾衰竭对肝脏胆汁酸生成限速酶的影响两组中7α-羟化酶的表达在mRNA及蛋白质水平上都无明显差异。而且在对一种胆酸合成酶Cyp8b1的mRNA表达检测中发现肾衰竭组和假手术组基本无差别。3.肾衰竭对肝脏、回肠、肾脏中胆汁酸转运蛋白表达情况的影响肾衰竭组大鼠肝脏基底侧胆汁酸摄取转运蛋白在mRNA及蛋白质水平均无明显差异,然而基底侧胆汁酸输出蛋白Mrp3,Ost-α, Ost-β的mRNA水平明显增高,蛋白免疫印迹实验进一步证明Mrp3, Ost-α在蛋白质水平上表达升高。在肝脏的毛细胆管侧,胆汁酸输出蛋白的表达与假手术组无明显差异。由于Mrp3, Ost-α以及Ost-β都是Fxr基因的靶向基因,而Fxr基因可以被胆汁酸激活,因此我们又对肾衰竭组、假手术组中的Fxr基因以及其下游的Shp基因进行了对比。通过对比发现两组中Fxr基因、Shp基因的mRNA水平无明显差异。Shp基因的表达与7α-羟化酶基因表达情况一致,表明血浆中高胆汁酸水平并没有对肝脏胆汁酸的从头合成途径进行负反馈调节。在肝脏中出现的胆汁酸转运蛋白表达改变并没有出现在回肠及残余的1/6肾脏组织中。Fxr基因以及Shp基因的表达情况也在回肠、肾脏组织中进行了检测,同样,肾衰竭组与假手术组间无明显差别,表明Fxr信号途径在肾衰竭组中并没有被激活。4.FXR基因激动剂对肾衰竭大鼠近端肾小管上皮细胞中FXR的靶向基因的影响将含有以上实验得到的大鼠近端肾小管上皮细胞中加入FXR基因激动剂后FXR基因的靶向基因Shp和Mrp2的mRNA水平明显升高,与此同时,FXR基因表达水平无明显变化。胆汁酸转运蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表达水平明显升高,Slcolal的mRNA表达水平降低。FXR基因信号通路在肾衰竭情况下仍然保持完整有效,刺激FXR基因信号通路会对近端肾小管上皮细胞中胆汁酸转运蛋白的表达产生影响。5.单侧肾切除对肝肾及肾脏胆汁酸转运蛋白的影响单侧肾切除大鼠血浆总胆汁酸水平也会升高,与此同时,肝脏胆汁酸合成限速酶7α-羟化酶的表达无明显改变。肝脏基底侧胆汁酸转运蛋白Ost-α和Ost-β的mRNA表达水平升高,而残留肾脏中胆汁酸转运蛋白较对照组无明显差异。6.肾衰竭组及对照组患者血浆生化指标及尿胆汁酸水平统计结果在本研究中我们发现,血浆总胆汁酸、肌酐、甘油三酯水平较对照组升高,差别有统计学意义,这种生化指标的改变符合肾衰竭患者的一般规律。谷丙转氨酶、谷草转氨酶、胆固醇在、血糖水平在两组中的差别无统计学意义。肾衰竭组尿中总胆汁酸浓度与对照组间无明显差别,然而肾衰竭组24h尿量较对照组明显减少,因此24h尿胆汁酸总量明显减少,差别有统计学意义。7.肾脏组织病理学检查结果在肾衰竭组,我们看到肾小球系膜细胞、血管内皮细胞增生,肾小球硬化、肾间质纤维化、肾血管硬化等病理改变。8.肾小球滤过率及其与血浆总胆汁酸水平的关系两组中估算的肾小球滤过率有明显差异：在肾衰竭组中,通过公式计算出的肾小球滤过率平均值为27.56ml/min/1.73m2,对照组计算出的肾小球滤过率平均值为100.44ml/min/1.73m2。皮尔森相关分析计算出血浆总胆汁酸水平与肾小球率过滤之间是相关的。而在对照组中,血浆总胆汁酸水平与肾小球率过滤之间无相关关系。9.肾衰竭患者肾脏组织中胆汁酸转运蛋白表达情况肾衰竭组胆汁酸转运蛋白与对照组在转录水平无明显差异,在蛋白质水平上也无明显差异。结论：1.动物实验表明肾衰竭以及单侧肾切除都能够导致血浆总胆汁酸水平升高,因此血浆总胆汁酸水平升高在肾脏功能受到损害的初期就能表现出来。本次肾衰竭模型试验中观察到,胆汁酸从头合成途径未受到影响,肝脏细胞基底侧Mrp3, Ost-α, Ost-β基因表达增强。这可能是对肾衰竭环境产生的反应,通过提高血浆总胆汁酸水平向其他组织中传导信号；或者是肝脏对肾衰竭环境的一种自我保护机制,使胆汁酸更容易从肝脏细胞基底膜侧排出肝脏。2.在对肾衰竭患者的研究表明肾小球对胆汁酸滤过的减少是造成肾衰竭患者血浆总胆汁酸水平增高的主要原因。而肝脏及肠道是否也在其中起到作用仍待进一步研究。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R692.5

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