罗汉果葫芦二烯醇的生物合成及葫芦烷型三萜生物活性研究

发布时间：2018-01-28 22:23

本文关键词： 葫芦二烯醇罗汉果醇罗汉果苷V 酿酒酵母生物合成药理活性 AMPK 药代动力学　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：罗汉果甜苷,是一种葫芦烷型三萜皂苷,不仅是传统中药罗汉果的主要活性成分,还是非糖类纯天然甜味剂。药理学研究表明罗汉果甜苷具有镇咳祛痰、润肺保肝,抗炎、抗癌、降血糖等作用,已成为为数不多的从中药中发掘出来的具有治疗功能的新型甜味剂。在罗汉果甜苷的生物合成途径中,葫芦二烯醇合酶是葫芦烷型三萜骨架合成的第一个限速酶,也是此条途径唯一的环化酶,可催化底物2,3-氧化鲨烯生成葫芦二烯醇。随后葫芦二烯醇在P450酶和和葡萄糖基转移酶的作用下,依次形成罗汉果醇和罗汉果苷。葫芦二烯醇是葫芦烷型三萜化合物罗汉果苷和葫芦素的基本母核,具有抗炎、癌细胞防治功效,与很多萜类相似,葫芦二烯醇在植物中的含量很低,因而限制了其规模化生产和广泛应用。本文利用合成生物学方法在酿酒酵母中构建葫芦二烯醇合成途径,经途径和发酵过程优化,为实现葫芦二烯醇及其下游产物的生物合成奠定了有利基础。此外,还以罗汉果甜苷V及其前体罗汉果醇和葫芦二烯醇为研究对象,进行体外活性及大鼠血浆中药代动力学研究,为葫芦烷型化合物的开发利用提供了理论依据。现将主要研究结果叙述如下:(1)构建了葫芦二烯醇酵母表达体系在对比酵母菌株生长速率、鲨烯底物的前提下,初步选择改造实例丰富,代谢旺盛的优势酵母菌株BY4742作为底盘菌株。同源CS基因进行密码子优化后导入酿酒酵母,实现了葫芦二烯醇在酿酒酵母中的合成,而且表达SgCS基因获得葫芦二烯醇产量可达7.30 mg/L。(2)建立了多种代谢调控策略克隆到酵母转录因子UPC2基因,转化到重组酵母菌株后,GC-MS分析产物发现,过表达UPC2基因可提高葫芦二烯醇产量,是出发菌株产量的3倍,为21.47mg/L。此外,外源物质的添加对产物葫芦二烯醇的合成具有一定的促进作用,茉莉酸甲酯添加浓度为0.5 mg/L时,产物葫芦二烯醇与对照相比约增加了 50%;水杨酸添加浓度为0.5 mg/L时,产物葫芦二烯醇与对照相比约增加了 35%。(3)发酵工艺优化正交试验优化了重组酵母发酵生产葫芦二烯醇的培养条件,发现以200 rpm,pH 5.0,空气流量50 L/h在30℃条件下进行发酵培养有利于酵母菌株生长和产物葫芦二烯醇的积累。并在此基础上进行分批补料发酵,结果发现葡萄糖补料发酵可显著提高目标产物单位体积产量和菌株BY4742-SgCS的生物量,最终产物滴度为16 mg/L,约为对照组的2.8倍。此外,在补加葡萄糖的同时添加无机盐溶液,可进一步提高产物约25%,最终得到产物滴度为20 mg/L。(4)体外药理活性肿瘤细胞增殖抑制活性研究结果表明,罗汉果醇(MO)对A-549、BEL-7402和HL-60细胞均具有一定抑制作用;罗汉果苷V(MV)和葫芦二烯醇(CU)对A-549细胞具有一定抑制作用,可作为候选药物进行后续研究。AMPK激活试验结果表明,受试物MO和MV在分子水平可以激活AMPK,MO的最大激活倍数和ECs0分别为2.3倍和4.2 μM;MV的最大激活倍数和ECs0分别为2.4倍和20.4 μM。这一发现为我们深入了解罗汉果甜苷的降糖机制提供了线索,并为天然AMPK激动剂类新型抗糖尿病药物的发现提供参考。(5)药代动力学研究建立了同时测定大鼠血浆中MV及其苷元MO的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法,并进行了完整的方法确证。大鼠静脉注射给药MV后,可在大鼠血浆中同时检测到MV和MO的存在,2min时MO与MV的浓度比仅为4.61%;但随着时间的推移,MO与MV的浓度比越来越大,直至6 h时二者的比值为132%,表明MV在大鼠体内可迅速脱糖,生成代谢产物MO。大鼠灌胃给药MV后,在大鼠血浆中未检出MV的存在,但可检出少量的MO,并经浓度和剂量归一化处理后测得生物利用度值为8.73±1.46%。大鼠静脉注射给药MO后,MO在大鼠体内的消除半衰期为1.40±0.09h。大鼠灌胃给药MO后,MO在大鼠体内的消除半衰期为2.41±0.11h,达峰时间tmax为0.39±0.10h,并经剂量归一化处理后获得的绝对生物利用度值为10.3±2.15%。结果表明,口服给药MV及其苷元MO后,MO可迅速吸收进入循环系统,约在0.38 h达峰浓度。然而,生物利用度相对偏低,可能与首过效应和给药后在体内发生强烈代谢相关。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284

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