星形胶质细胞自噬在神经病理性疼痛中的作用及机制研究

发布时间：2018-01-30 02:33

本文关键词： 神经病理性疼痛星形胶质细胞自噬神经炎症活性氧　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究目的神经病理性疼痛是常见的一类慢性疼痛,发病机制复杂,临床缺乏有效治疗措施。最近研究发现,胶质细胞在神经病理性疼痛发生发展中具有重要作用。星形胶质细胞是神经系统中数量最多的胶质细胞,生理状态下,星形胶质细胞负责支持、分离、营养神经元以及构成血脑屏障和神经突触,对维持中枢神经系统稳态、保护神经元免受氧化应激损伤具有重要作用。外周神经损伤时,星形胶质细胞活化,一方面通过释放多种细胞因子,如CCL7、MMP2等维持小胶质细胞活化和神经元敏化;另一方面,由于星形胶质细胞构成的血脑屏障的破坏,导致非神经系统细胞,如T细胞、B细胞、巨噬细胞等进入神经系统,从而加剧了神经炎症反应和疼痛敏化。自噬是生物学进化保守的过程,在机体生理病理过程中发挥重要作用。自噬与炎症免疫和氧化应激关系紧密,大量文献发现,自噬一方面参与抗原呈递以及炎症免疫的生成,另一方面自噬可以通过清除受损的蛋白质、细胞器等抑制炎症反应。自噬介导星形胶质细胞分化与活化,而星形胶质细胞自噬受损介导多种疾病的形成。在炎症刺激诱导星形胶质细胞线粒体动力学改变的过程中,自噬受损影响线粒体功能恢复。星形胶质细胞自噬是否参与神经病理性疼痛的发生以及调控机制尚待研究证实。本文拟探索星形胶质细胞自噬在神经病理性疼痛过程中的作用及其相关机制。研究方法应用C57小鼠,L5脊神经结扎(SNL)构建神经病理性疼痛模型,利用Von Frey纤维针和哈格里夫斯辐射热仪分别检测机械性触诱发痛和热痛觉过敏阈值变化。分别用ELISA法和免疫荧光标记8-HOG分子检测脊髓神经炎症水平和活性氧水平,Western blot、电镜、免疫荧光单标及双标、自噬流抑制试验的方法检测SNL术后脊髓自噬水平变化。分别在神经病理性疼痛早期阶段和晚期阶段鞘内注射自噬抑制剂(3-MA)和自噬诱导剂(Rapamycin),检测自噬水平改变对神经病理性疼痛水平和脊髓神经炎、活性氧水平影响。通过细胞实验与在体实验相结合,进一步探索星形胶质细胞自噬改变对神经炎症与活性氧水平影响的分子机制。结果1)SNL术后小鼠机械性触诱发痛和热痛觉过敏阈值降低,脊髓IL-1β、TNF-α、CCL7、MMP2以及活性氧水平升高,活性氧主要存在神经元中。2)westernblot和免疫荧光结果显示snl术后脊髓lc3-Ⅱ水平先增加后降低,snl3d达到峰值,snl14d恢复正常水平,而p62水平持续增加,维持至少28d。我们电镜结果显示snl3d脊髓组织中自噬小体显著增加而溶酶体很少,而snl14d脊髓组织中自噬小体很少而溶酶体较多。自噬流抑制试验显示snl14d脊髓组织自噬流受损。免疫荧光双标显示,snl3d脊髓组织中lc3-Ⅱ主要表达在神经元,而snl14d组织中p62主要表达于星形胶质细胞,这一结果提示snl术后脊髓自噬流受损具有时间特异性和细胞特异性。3)虽然不论早期阶段还是晚期阶段,鞘内注射自噬抑制剂(3-ma)加重神经病理性疼痛,而鞘内注射自噬诱导剂(rapamycin)缓解疼痛,但在神经病理性疼痛不同阶段抑制或者活化自噬对神经炎症和活性氧的影响是不同的,表现为在神经病理性疼痛早期阶段活化自噬降低il-1β、tnf-α水平而增加ccl7、mmp2水平,抑制自噬增加il-1β、tnf-α水平,但对ccl7、mmp2水平无影响;而在疼痛晚期阶段抑制自噬增加脊髓神经炎症和活性氧水平,活化自噬降低神经炎症水平但对活性氧水平无影响。4)我们进一步研究发现nrf2至少部分参与了星形胶质细胞自噬对脊髓神经元活性氧的调节,因为我们在体实验表明,晚期阶段rapamycin处理显著降低脊髓nrf2水平,细胞实验同样证明自噬活化降低星形胶质细胞自噬水平,而通过抑制keap1活化nrf2则显著显著降低rapamycin处理组的活性氧水平,并且增加神经病理性疼痛阈值,但对dmso处理组疼痛阈值无影响。5)细胞实验表明抑制自噬降低il-1β、tnf-α刺激早期星形胶质细胞来源的ccl7、mmp2水平但增加晚期星形胶质细胞来源的ccl7、mmp2水平,jnk、nf-κb通路而非erk、p38通路介导了自噬抑制后晚期ccl7、mmp2水平增加,因为抑制自噬增加晚期jnk、nf-κb磷酸化水平而对erk、p38磷酸化水平无影响,抑制jnk、nf-κb而非erk、p38可以显著逆转自噬抑制引起的晚期ccl7、mmp2水平增加。结论1)snl术后脊髓自噬流受损具有时间特异性和细胞类型特异性;2)不论早期阶段还是晚期,活化自噬缓解疼痛,抑制自噬加重疼痛;3)神经病理性疼痛不同阶段活化或者抑制自噬对神经炎症以及活性氧的影响是不同的;4)nrf2通路至少部分参与星形胶质细胞自噬对脊髓神经元活性氧水平的调节;5)星形胶质细胞中,jnk、nf-κb通路而非p38、erk通路介导了自噬抑制所引起的晚期CCL7、MMP2水平的增加。
[Abstract]:This paper studies the role of astrocytes in the pathogenesis of neuropathic pain . The results suggest that the self - tophagocytosis of the spinal cord in the early stage of neuropathic pain significantly decreases the levels of active oxygen in the spinal cord and increases the levels of ccl7 and mmp2 . Conclusion 1 ) There is time - specific and cell - specific specificity of self - tophagocytosis in spinal cord after snl operation .

【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R402

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