3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对胃癌细胞SGC-7901及裸鼠胃原位移植瘤的影响及作用机制研究

发布时间：2018-02-02 03:02

本文关键词： 胃癌 3-溴丙酮酸柠檬酸钠糖酵解凋亡　出处：《广西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的胃癌(Gastric Cancer,GC)是最常见的恶性肿瘤之一,近年来,虽然手术,化疗、放疗等取得了巨大的进步,但胃癌的5年生存率仍不理想。因此,寻找新的治疗靶点,提高患者生存率迫在眉睫。80年前Warburg发现恶性肿瘤细胞在有氧条件仍然更多依赖糖酵解来获取能量(Adenosine triphosphate,ATP)。恶性肿瘤细胞的这一特点,为抗肿瘤药物的研究提供了一个靶点,即我们可以通过抑制糖酵解来杀灭肿瘤细胞。糖酵解反应中,己糖激酶(Hexokinase,HK)、磷酸果糖激酶1(6-Phosphofructokinase-l,PFK-1)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)通过控制反应的关键步骤来调节糖酵解的速率。因此,如果药物能抑制这些关键酶的活性,则可以发挥抗肿瘤的作用。3-溴丙酮酸(3-Br PA)是一种强烷化剂,我们课题组及其他学者的研究均显示3-Br PA能通过结合HK的活性位点,从而抑制该酶的活性。柠檬酸钠(SCT)是一种常用于食品添加剂中的化合物,我们前期研究表明SCT能通过结合PFK-1的活性区域,抑制其活性。因此3-Br PA及SCT能通过抑制关键酶来控制糖酵解的速率,导致细胞供能减少。而研究已表明当肿瘤细胞发生能量枯竭时,可出现持续的DNA降解,线粒体膜通透性改变,引起细胞色素C(Cyt-C)的释放,激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase),从而诱导肿瘤细胞的凋亡。通过对细胞凋亡通路的研究,能更好的揭示抗肿瘤药物作用机制。我们前期研究已经证明3-Br PA及SCT能抑制恶性胸膜间皮瘤及胃癌细胞增殖,但其具体作用的机制仍未完全阐明,尤其是腹腔内应用3-Br PA及SCT能否发挥其抗肿瘤效应及其作用机制国内外尚未见报道。因此,本实验首先使用人胃癌细胞株SGC-7901行3-Br PA及SCT的体外实验,然后建立裸鼠胃原位移植瘤模型,腹腔内注射3-Br PA及SCT行体内研究。希望为胃癌治疗的探索提供一些可供参考的研究依据。研究内容第一部分3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对胃癌细胞影响的体外实验实验方法:培养人胃癌细胞SGC-7901,MTT法检测3-Br PA及SCT对其增殖影响,确定体外实验药物浓度。分8个实验组:空白对照组(Control组),阳性对照组(5-FU组),3-Br PA低、中、高浓度组及SCT低、中、高浓度组。分别用药后,倒置显微镜观察胃癌细胞生长情况及形态改变;流式细胞技术检测细胞凋亡和周期;Hoechst 33258染色法检测细胞凋亡,激光共聚焦显微镜及荧光探针法检测reactive oxygen species(ROS)产量;紫外比色法检测HK、PFK-1、PK活性,分光光度法检测ATP和乳酸(Lactic acid,LC)含量;Western blot(WB)检测凋亡基因蛋白的表达。实验结果:1.MTT实验结果:3-Br PA、SCT能呈时间及浓度依赖性抑制胃癌细胞生长,3-Br PA对SGC-7901的半数抑制浓度(IC50)在24h、48h分别为9.88±1.07μg/ml、5.97±0.95μg/ml。而SCT的IC50在24h、48h分别为6.47±0.87 mg/ml、3.84±0.59 mg/ml。2.倒置显微镜观察结果:3-Br PA、SCT及5-FU可显著抑制胃癌细胞的增殖,随着3-Br PA、SCT浓度增加,活细胞数明显减少细胞排列稀疏,变圆,空白对照组细胞排列紧密,细胞呈多边形。3.流式细胞技术检测结果:用药24 h、48 h后,3-Br PA组及SCT组细胞凋亡率随药物浓度增加或作用时间延长而显著增高(P0.05)。3-Br PA组中细胞凋亡率由15.60±1.83%增加至84.45±3.97%;SCT组中从19.31±1.89%增至88.34±5.22%。5-FU组细胞凋亡率在24 h及48 h分别为61.57±4.30%及92.64±4.15%。用药24h后,3-Br PA、SCT组及5-FU组中,G2/M期细胞数目明显增多(P0.05),可见亚二倍体凋亡峰。5-FU组中,S期的细胞数也明显增加(P0.05)。4.Hoechst 33258染色结果:3-Br PA、SCT组及5-FU组可见凋亡细胞明显增多(P0.05),表现为核固缩或崩解,细胞呈明显的亮蓝色,凋亡率随3-Br PA、SCT浓度的增高而增大(P0.05),而空白对照组未见明显的凋亡细胞。5.ROS产量检测结果:用药4h后,3-Br PA、SCT组及5-FU组中胞内ROS的产量较空白对照组明显增多(P0.05),通过激光共聚焦显微镜观察,可见亮绿色细胞数量和荧光强度均随着3-Br PA、SCT浓度增高而上升(P0.05)。6.细胞内HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC产量检测结果:用药24h、48 h后,3-Br PA组HK活性较SCT组及空白对照组均显著降低(P0.05),且呈药物浓度及作用时间依赖性,5-FU组中HK活性亦较SCT组和空白对照组低(P0.05)。SCT组HK活性与空白对照组相比未见明显的差异(P0.05)。SCT组PFK-1活性随药物浓度增加及作用时间延长而显著降低(P0.05),3-Br PA组及5-FU组PFK-1活性与空白对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。PK活性在各实验组中均未见明显差异(P0.05)。3-Br PA组及SCT组ATP和LC产量较空白对照组均明显减少(P0.05),表现为时间和药物浓度的依赖性。5-FU处理细胞8h后ATP产量减少,处理48h后乳酸也较空白对照组降低(P0.05)。7.WB实验结果:Bax、Cyt-C及Cleaved caspase-3蛋白表达量随3-Br PA及SCT药物浓度的增加而明显增高,而Bcl-2、Survivin蛋白的表达则较空白组明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。5-FU组中Bcl-2、Survivin蛋白表达较空白对照组明显降低,而Bax、Cyt-C及Cleavedcaspase-3则较之增高(P0.05)。实验结论:3-Br PA、SCT在体外能显著抑制人胃癌细胞株SGC-7901的增殖,导致细胞周期阻滞,抑制糖酵解关键么活性并通过ROS蓄积,激活线粒体凋亡通路,抑制Survivin蛋白表达而诱导肿瘤细胞凋亡。第二部分人胃癌细胞裸鼠胃原位移植瘤模型构建及Micro-PET/CT检测实验方法:取6只雌性BALB/C裸鼠,于双侧前肢腋背部皮下注射200ul胃癌细胞悬液。待裸鼠皮下瘤长至直径约8-10mm时,取出皮下移植瘤,进行鼠间传代,共6代。取150只雌性BALB/C裸鼠,麻醉后通过医用OB生物胶黏贴法将肿瘤组织块种植于胃壁浆肌层下,建立裸鼠胃原位癌模型。术后2周,随机分成8组,每组18只,每日一次腹腔注射相应药物,观察裸鼠体重、饮食及活动度变化。连续用药4周后,每组随机选取6只裸鼠,利用18F-FDG作为放射性示踪剂,行Micro-PET/CT扫描,余裸鼠用于后续实验。实验结果:1.成功构建人胃癌细胞SGC-7901裸鼠胃原位移植瘤模型,成瘤率约95%。2.腹腔注射实验浓度的3-Br PA及SCT后,裸鼠体重缓慢增长,未见明显饮食及活动度下降。3.各组胃原位移植瘤病灶放射性示踪剂集聚值(%ID/g)分别为:3-Br PA-L组2.703±0.214、3-Br PA-M组2.047±0.286、3-Br PA-H组1.348±0.142、SCT-L组2.527±0.279、SCT-M组1.975±0.245、SCT-H组1.228±0.136、5-FU组2.187±0.276、PBS组3.285±0.389。3-Br PA组及SCT组中18F-FDG集聚随着药物浓度的升高而减少,与PBS组对比有明显差异(P0.05)。5-FU组中18F-FDG集聚也较PBS组降低,对比具有显著性差异(P0.05)。实验结论:通过医用OB生物胶黏贴法可成功构建裸鼠胃原位移植瘤模型,腹腔注射3-Br PA及SCT可安全、有效地降低肿瘤细胞代谢,抑制肿瘤生长。第三部分3-溴丙酮酸、柠檬酸钠对裸鼠胃原位移植瘤影响的体内研究实验方法:构建裸鼠胃原位移植瘤模型,连续腹腔注射相应药物4周后,各组随机选取6只裸鼠,检测血常规及肝肾功能;测量移植瘤体积及重量;HE染色观察移植瘤组织病理形态,肝肾组织病理学改变;紫外比色法检测移植瘤HK、PFK-1、PK活性,分光光度法检测ATP及乳酸含量;TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡;透视电镜(TEM)观察移植瘤细胞超微结构;RT-q PCR检测相关凋亡基因m RNA表达;免疫组织化学法(IHC)检测相关凋亡蛋白表达;各组余裸鼠继续用药至死亡,统计生存时间。实验结果:1.裸鼠血常规及肝肾功能:3-Br PA组及SCT组裸鼠白细胞、血红蛋白、血小板、白蛋白、谷丙转氨酶、总胆红素、肌酐及尿素氮与PBS组比较,均无明显差异(P0.05);5-FU组裸鼠白细胞、血小板及白蛋白可见不同程度降低,而谷丙转氨酶、总胆红素、肌酐及尿素氮可见不同程度的升高,与PBS组对比均有显著性差异(P0.05)。但各组裸鼠的血红蛋白未见明显异常(P0.05)。2.移植瘤生长及裸鼠生存时间:3-Br PA组、SCT组及5-FU组移植瘤体积及重量均较PBS组减小,差异有统计学意义(P0.05),随着3-Br PA及SCT浓度增加,其瘤体积及瘤重抑制率均增强。3-Br PA组,SCT组及5-FU组裸鼠生存时间均较PBS组明显延长(P0.05)。3.移植瘤HK、PFK-1、PK活性及ATP和LC产量:3-Br PA组HK活性随药物剂量增加而降低,而SCT组及PBS组未见明显改变,对比有统计学意义(P0.05),5-FU组HK活性也较SCT组和PBS组减低(P0.05)。SCT组PFK-1活性显著低于3-Br PA组、5-FU组及PBS组(P0.05),呈剂量依赖性改变。各组PK活性未见明显差异(P0.05)。3-Br PA组、SCT组及5-FU组ATP和LC产量与PBS组对比,均可见明显降低(P0.05),且3-Br PA组及SCT组中ATP和LC产量改变呈药物浓度依赖性。4.移植瘤及肝肾组织HE染色:移植瘤组织HE染色可进一步证明模型成功建立。3-Br PA组及SCT组裸鼠肝肾组织切片中未见明显组织病理学改变,而5-FU组可见点状坏死、细胞空泡样改变或炎性细胞浸润等改变。5.TUNEL染色及TEM结果:3-Br PA组及SCT组移植瘤平均凋亡指数(AI)呈剂量依赖性升高,与PBS组对比,差异有统计学意义(P0.05),5-FU组AI较PBS组亦可见明显增高(P0.05)。3-Br PA组、SCT组及5-FU组移植瘤细胞中可见典型的细胞凋亡超微结构改变:细胞皱缩或破裂,胞核碎裂、染色质边聚,胞质内空泡形成,内质网肿大,线粒体水肿呈空泡样变性,线粒体嵴模糊、消失,凋亡小体形成等。而PBS组移植瘤细胞胞核较大核仁明显,未见明显凋亡变化。6.IHC结果:3-Br PA组及SCT组移植瘤中cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白表达量随药物浓度升高而增多,与PBS组相比均可见明显差异(P0.05)。此外,cleaved caspase-9、cleaved caspase-3蛋白在5-FU组中表达量亦明显高于PBS组,差异有统计学意义(P0.05)。7.RT-q PCR检测结果:3-Br PA组及SCT组移植瘤中Bax、Cyt-C m RNA表达均呈剂量依赖性升高,而Bcl-2、Survivin的表达则呈剂量依赖性降低,与PBS对照组相比均具有显著差异(P0.05)。同时,在5-FU组移植瘤中Bax、Cyt-C也较PBS组表达增加,而Bcl-2、Survivin表达则明显减少(a P0.05)。实验结论:腹腔内注射3-Br PA及SCT能安全有效的抑制裸鼠原位移植瘤的生长、延长荷瘤鼠生存时间,诱导原位移植瘤细胞凋亡。全文结论:本研究分别通过内体外实验,研究3-BrPA及SCT对胃癌细胞SGC-7901的影响,并探索其抗肿瘤作用机制。(1)体外实验表明3-Br PA及SCT可通过阻滞细胞周期,抑制糖酵解关键酶HK及PFK-1的活性、抑制胃癌细胞糖酵解速率、减少ATP及乳酸产量,导致细胞能量枯竭。并首次发现3-Br PA及SCT可促进细胞内ROS蓄积,上调线粒体凋亡通路中Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达,从而引起Cyt-C的释放,激活caspase-3,同时抑制抗凋亡蛋白Survivin的表达来促进胃癌细胞出现凋亡。(2)通过建立裸鼠胃原位移植瘤模型,在国内外属首次通过腹腔内注射途径应用3-Br PA及SCT并结合18F-FDG Micro-PET/CT扫描来研究评估药物的抗肿瘤作用,结果证实腹腔内使用3-Br PA及SCT同样可以抑制糖酵解酶活性,降低胃原位移植瘤组织糖酵解反应水平,进而导致细胞能量耗竭、酸性微环境破坏,引起DNA持续降解,并上调促凋亡基因Bax、Cyt-C m RNA的表达、下调抑凋亡基因Bcl-2及Survivin m RNA的表达,活化caspase-9及caspase-3来共同发挥其抗肿瘤的作用。因此,3-Br PA及SCT确实能安全有效抑制胃癌细胞,值得进一步深入研究。
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】