p27基因敲除通过激活Shh信号通路发挥椎间盘退变保护作用

发布时间：2018-02-04 20:34

本文关键词： 小鼠椎间盘退变动物模型 p27 基因敲除椎间盘退变 p27基因 Sonic Hedgehog信号通路椎间盘退变　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一章小鼠椎间盘退变动物模型的建立目的建立一种操作简单、方便、实用的小鼠椎间盘退变动物模型。方法4周龄SPF级野生型(Wild Type,WT)小鼠72只,随机分为两组,对照组(Con)和悬尾组(Tail Suspension,TS),分别于2周、4周、8周时间点,通过X光摄片机行小鼠腰椎正侧位扫描(CR),计算椎间盘高度指数;HE染色观察小鼠椎间盘髓核和纤维环改变情况。Western-blot检测椎间盘组织中P27蛋白的表达。结果小鼠腰椎X线表明:从4周开始,悬尾组小鼠开始出现椎间隙变窄,椎体结构不稳;至8周时椎间隙进一步变窄,并出现脊柱侧凸畸形,椎体边缘及椎体上下软骨终板可见不同程度的钙化,并可见少量的骨赘形成。而正常对照组仅在8周表现为椎间隙轻度狭窄。统计学表明:悬尾组小鼠椎间盘高度指数(Disk Height Index,DHI)随着时间的延长,呈逐渐下降趋势。与正常对照组相比,差异具有统计学意义(P0.05);HE染色结果显示:尾部悬吊组小鼠椎间盘髓核细胞减少,基质中胶原纤维排列紊乱,发生了严重的髓核和纤维环退变。而正常对照组小鼠的椎间盘仅发生轻度退变,胶原纤维排列尚整齐。Western-blotting检测悬吊组小鼠椎间盘组织中P27蛋白的表达较对照组明显增高,差异具有统计学意义(P0.05)。结论采用小鼠尾部悬吊8周的方法,可以有效构建小鼠椎间盘退变动物模型。该方法具有无损伤、操作简单,稳定性和重复性好等优点。第二章p27基因在小鼠椎间盘退变中的作用目的明确P27基因在小鼠椎间盘退变过程中的作用。方法将4周龄野生型(WT)和p27基因敲除(p27-/-)小鼠,通过第一部分所建立的小鼠椎间盘退变动物模型制作方法,持续悬吊8周后诱导两组(TS-WT,TS-p27-/-)小鼠椎间盘发生退变。分别设置未悬吊WT(Con-WT)和未悬吊p27-/-小鼠(Con-p2-/-)为对照组。通过X光摄片机拍摄两组小鼠腰椎正侧位(CR),计算椎间盘高度指数(DHI),明确腰椎及椎间盘退变情况;HE染色观察小鼠椎间盘髓核和纤维环退变情况。结果小鼠腰椎X线表明,Con-p27-/-组和Con-WT组小鼠腰椎序列整齐,椎体边缘无明显骨赘形成,椎间隙无明显狭窄。而TS-WT则表现为腰椎序列不整,椎体边缘骨质增生明显,椎间隙变窄,部分小鼠甚至出现腰椎侧弯畸形。椎间盘高度指数(Disk Height Index,DHI)统计结果表明:TS-p27-/-组小鼠DHI高于TS-WT小鼠组,两组DHI相比,差异有统计学意义(P0.05);HE染色显示,Con-p27-/-和Con-WT小鼠组椎间盘纤维层次分明,与髓核界线清楚,视野内有丰富的空泡细胞和小的类软骨样细胞,胶原蛋白排列成规则;TS-27-/-小鼠组纤维环排列尚整齐,而TS-WT小鼠组椎间盘纤维环排列严重紊乱,部分发生撕裂,髓核细胞减少甚至消失等退变表现;Con-p27-/-和Con-WT小鼠组椎间盘组织学评分差异无统计学意义(P0.05);TS-p27-/-组椎间盘组织学评分低于TS-WT组,差异有统计学意义(P0.05)。结论p27基因缺失后可明显延缓椎间盘的退变,p27基因在椎间盘退变过程中发挥负性调控作用。第三章p27基因敲除通过激活Shh信号通路发挥椎间盘退变保护作用目的明确p27基因是否通过Sonic Hedgehog(Shh)信号通路负性调控小鼠腰椎间盘退变。方法在实验一和实验二的基础上,将实验二收集的各组小鼠腰椎和椎间盘,采用免疫荧光法检测Shh信号通路相关蛋白的表达;Western-blotting检测椎间盘组织中Shh信号通路相关蛋白的表达含量,采用Image图像分析软件对荧光光密度值和蛋白灰度值进行定量分析,采用SPSS 13.0统计软件进行数据统计分析。结果免疫荧光及Westen-bloting结果均表明,四组小鼠椎间盘组织中Shh、Smo、Patched及Gli-2蛋白均不同程度的表达,Con-p27--组小鼠椎间盘组织中Shh、Smo、Patched及Gli-2蛋白表达及含量最高;TS-p27-/-组上述蛋白含量有所降低,但仍高于Con-WT组;TS-WT小鼠组蛋白表达水平最低,各组间相比差异具有统计学意义(P0.05);结论p27基因缺失后,可激活Shh信号通路,减缓椎间盘退变,对小鼠椎间盘退变起到保护作用。
[Abstract]:In the first chapter , we established a simple , convenient and practical animal model of intervertebral disc degeneration in mice . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P0.05 ) . The results showed that there was no significant difference between the two groups ( P0.05 ) . the degeneration of the intervertebral disc is slowed down , and the degeneration of the intervertebral disc of the mouse is protected .

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R681.53

【参考文献】