重组irisin抑制动脉粥样硬化的形成及其机制研究

发布时间：2018-02-10 03:27

本文关键词： Irisin 动脉粥样硬化内皮细胞 microRNA 氧化低密度脂蛋白　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景:动脉粥样硬化,一种慢性进展性的血管病,是引起冠心病、脑梗死、外周血管病的首要原因,在全世界范围内具有很高的发病率和致死率。它是由多因素共同作用引起的,主要危险因素有高血压、高血脂、大量吸烟,还有糖尿病、肥胖和遗传因素等。动脉粥样硬化的发病机制复杂,目前尚未完全阐明,其中内皮功能紊乱和炎症起着至关重要的作用。内皮细胞通过其细胞间紧密连接的复合体,在血液和组织之间形成了一个选择性的透过屏障,所以内皮的完整性是维持血管稳态的一个基本因素。正常内皮细胞可以调节血管紧张度及血管结构并且分泌抗凝、抗血小板物质和纤溶蛋白,防止细胞向血管壁粘附聚集,具有抗炎症反应的作用。当受到各种有害刺激之后,病灶处的单层内皮细胞被活化而分泌粘附分子,引起白细胞粘附,进而引起血管损害。各种危险因素可引起血管内皮损伤进而导致动脉粥样硬化的发生和发展。许多研究证实内皮功能失调不但是始发因素,而且是动脉粥样硬化进展中的重要因素,具有足够存活能力和增殖能力的内皮细胞对维持内皮完整性和修复内皮损伤至关重要。所以,维持血管内皮完整性、改善和提高内皮功能是治疗和预防动脉粥样硬化的关键。近年来骨骼肌已经被确定为是一个内分泌器官。由骨骼肌在运动中或者运动后随即分泌的细胞因子,被称为肌因子,介导了锻炼对代谢和心血管系统产生的一些有益作用。Irisin,一种新发现的肌因子,是运动后由骨骼肌产生的。它主要通过促进产热基因解偶联蛋白的表达促进白色脂肪棕色化,从而增加能量消耗、调节葡萄糖稳态,与肥胖、胰岛素抵抗等密切相关。最近,越来越多的研究证实,irisin可以改善肥胖、2型糖尿病、心血管疾病患者的内皮功能。但是,irisin在动脉粥样硬化斑块形成中的作用及其机制,尚未有报道。研究目的:1.通过建立小鼠动脉粥样硬化模型,研究irisin对动脉粥样硬化形成的影响。2.通过体内、外实验研究irisin对内皮细胞增殖、炎症、凋亡的影响,并阐明其分子机制。研究方法:1.表达与纯化人重组irisin蛋白。2.建立两种小鼠动脉粥样硬化模型:单纯高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠模型和颈总动脉部分结扎ApoE-/-小鼠模型。单纯高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠模型:将16只8周龄的ApoE-/-小鼠,均给予高脂饲料喂养,在喂养的第四周将小鼠随机分成两组,每组8只,分别给予0.5μg/g体重/天irisin和等量生理盐水腹腔注射。在喂养12周后,取主动脉和主动脉根部用4%多聚甲醛固定。颈总动脉部分结扎ApoE-/-小鼠模型:将10只8周龄的ApoE-/-小鼠行左侧颈总动脉部分结扎,结扎后随机分成两组,每组5只,分别给予0.5 μg/g体重/天irisin和等量生理盐水腹腔注射,术后4周取左侧颈总动脉用4%多聚甲醛固定。3.油红O染色检测irisin对小鼠主动脉及主动脉根部动脉粥样硬化斑块形成的影响;HE染色检测irisin对小鼠颈总动脉新生内膜形成的影响。4.CD31、Ki67标记的免疫荧光染色检测irisin对血管内皮增殖的影响。5.培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。6.BrdU免疫荧光标记法、CCK8法、MTT法检测irisin对人脐静脉内皮细胞增殖的影响。7.microRNA(miRNA)基因芯片分析筛查irisin处理人脐静脉内皮细胞后差异表达的miRNA。8.细胞、颈总动脉RNA提取及qRT-PCR检测相关microRNA、mRNA的表达。9.Western blot检测irisin处理后人脐静脉内皮细胞DLK1、p-ERK、p-eNOS及炎症、凋亡相关蛋白的表达。10.免疫组织化学染色检测irisin对血管炎症的影响。11.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测irisin对小鼠血清炎症因子水平的影响。12.TUNEL荧光标记法检测irisin对血管内皮细胞凋亡的影响。13.流式细胞术检测irisin对人脐静脉内皮细胞凋亡的影响。14.用脂质体 Lipofectamine2000 将 microRNA126-5p(miR126-5p)的抑制剂和Dlk1的小干扰RNA(siRNA)转染到人脐静脉内皮细胞。15.用50μl含有0.1mgmiR126-5p拮抗剂的F-127普郎尼克胶放在小鼠结扎后的颈总动脉的外膜周围,将miR126-5p拮抗剂转染到颈总动脉内。16.统计学分析:本研究中所有实验重复3次及3次以上。两组之间比较采用Student's t检验,多组之间比较采用单因素方差分析后Student-Newman-Keuls检验。P0.05被认为差异有统计学意义。研究结果:1.重组irisin可以抑制动脉粥样硬化斑块的形成:(1)高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠腹腔注射irisin 8周,油红O染色结果显示:irisin可以抑制主动脉和主动脉根部粥样斑块的形成。(2)左侧颈总动脉部分结扎的小鼠腹腔注射irisin4周,HE染色结果显示:irisin可以抑制颈总动脉斑块的形成。2.Irisin促进血管内皮细胞的增殖:免疫荧光结果显示irisin可以增加颈总动脉表达Ki67的内皮细胞数量。3.Irisin通过上调miR126-5p促进人脐静脉内皮细胞的增殖:(1)BrdU免疫荧光标记结果显示irisin促进HUVEC增殖。(2)CCK8实验的结果显示,与对照组相比,20nM的irisin使HUVEC增殖了约1.26倍。(3)microRNA基因芯片及qRT-PCR结果显示irisin可以使HUVEC中miR 126-5p的表达显著增加。(4)miR126-5p抑制剂抑制irisin诱导的miR126-5p表达后,BrdU免疫荧光染色和CCK8实验结果显示,miR126-5p抑制剂抑制了 irisin诱导的HUVEC的增殖。4.Irisin通过激活ERK信号通路促进miR126-5p表达:(1)Western blot结果显示,irisin可以使人脐静脉内皮细胞中磷酸化的ERK蛋白水平升高,ERK通路的抑制剂U0126可以抑制irisin诱导的ERK磷酸化。(2)qRT-PCR结果显示ERK通路的抑制剂U0126可以抑制irisin引起的miR126-5p 表达。(3)Western blot结果显示miR126-5p抑制剂对irisin引起的ERK磷酸化无影响。5.Dlk1 是 irisin 诱导的 miR126-5p 的靶基因:(1)qRT-PCR结果显示irisin可以使HUVEC中Dlk1的表达显著增加,ADAM9、MMP7与SDF-1α表达未受影响。(2)Western blot结果显示,irisin可以使HUVEC中Dlk1蛋白水平下降,miR126-5p抑制剂可以逆转irisin对Dlk1表达的抑制作用。(3)CCK8实验的结果显示Dlk1的小干扰RNA可以逆转miR126-5p抑制剂对irisin诱导的HUVEC增殖的抑制作用。6.抑制miR126-5p表达减弱了 irisin对颈总动脉斑块形成的抑制作用和对内皮细胞增殖的促进作用:(1)qRT-PCR结果显示腹腔注射irisin 4周可以使小鼠颈总动脉miR126-5p的表达增加约2.78倍,miR126-5p拮抗剂可以使irisin引起的小鼠颈总动脉miR126-5p的表达降低。(2)左侧颈总动脉部分结扎的小鼠腹腔注射irisin 4周,HE染色结果显示:miR126-5p拮抗剂可以减弱irisin对颈总动脉斑块形成的抑制作用。(3)免疫荧光结果显示miR126-5p拮抗剂可以抑制irisin引起的颈总动脉表达Ki67内皮细胞数量的增加。7.irisin抑制颈总动脉斑块中炎性细胞的浸润:免疫组织化学染色结果显示irisin可以减少颈总动脉斑块中CD68+巨噬细胞和CD3+T细胞的面积。8.irisin抑制颈总动脉斑块中炎症相关基因的表达:(1)qRT-PCR结果显示irisin可以使颈总动脉斑块中IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的mRNA水平减少。(2)ELISA 结果显示 irisin 可以使 ApoE-/-小鼠血清中 IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1的蛋白表达减少。9.irisin通过抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信号通路抑制ox-LDL诱导的HUVECs炎症反应:(1)qRT-PCR 结果显示 irisin 可以抑制 ox-LDL 刺激的 HUVECs 中 IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1 的 mRNA 水平。(2)Western blot结果显示irisin抑制了 ox-LDL诱导的p38MAPK磷酸化。(3)Western blot结果显示irisin抑制了 ox-LDL诱导的NF-κB p65和磷酸化的NF-κB p65表达,并且使磷酸化的NF-κB P65/NF-κB p65比值降低。(4)Western blot结果显示与ox-LDL处理组相比,irisin可以降低细胞核NF-κB p65的水平,提高细胞浆NF-κB p65的水平,抑制NF-κB p65的核移位。(5)DCFH-DA实验结果显示irisin抑制了 ox-LDL诱导的HUVECs内ROS表达。10.irisin抑制颈总动脉斑块中细胞凋亡:TUNEL荧光标记实验结果显示irisin可以减少颈总动脉斑块中细胞凋亡的数量。11.irisin 减少了 ox-LDL 诱导的 HUVECs 凋亡:流式细胞术结果显示,irisin有效减少了 ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。12.Irisin上调了 Bcl-2的表达,下调了 Bax和Caspase-3的表达:Western blot结果显示,irisin可以使Bcl-2的表达升高,Bax和Caspase-3的表达下降。结论:1.重组irisin可以抑制高脂喂养8周的ApoE-/-小鼠主动脉、主动脉根部及左侧颈总动脉部分结扎的ApoE-/-小鼠颈总动脉中动脉粥样硬化斑块的形成。2.体内、外实验均发现irisin能通过上调miR126-5p促进内皮细胞增殖。3.Irisin通过激活ERK信号通路上调miR126-5p的表达,进而抑制Dlk的表达。4.重组irisin可以减少动脉粥样硬化斑块中的炎性细胞浸润及炎性因子IL-6、MCP-1、ICAM-1 和 VCAM-1 的表达。5.体外实验发现irisin通过抑制ROS/p38 MAPK/NF-κB信号通路抑制ox-LDL刺激的HUVECs炎症反应。6..体内、外实验均发现irisin抑制内皮细胞凋亡。7.Irisin通过上调Bcl-2,下调Bax和Caspase-3的表达,抑制ox-LDL诱导的HUVEC凋亡。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.5

【参考文献】