以乳腺癌细胞为靶标筛选的二硫环化多肽FITC-PI跨膜转运机制研究

发布时间：2018-02-12 00:52

本文关键词： 二硫环化FITC-PI 小分子多肽乳腺癌肺癌肿瘤靶向治疗跨膜转导穿膜机制分泌性载体膜蛋白4 泛素-C蛋白　出处：《昆明医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[目的]本课题组前期研究发现了一种具有仅对人三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)和人肺癌细胞(Calu-1)这两种细胞系具有特异亲和性的11肽,将其进行FITC荧光标记后我们观察到其能够穿膜进入MDA-MB-231和Calu-1细胞并在胞浆内定位,后续实验提示,将此小肽两端添加二硫键环化处理后其特异性穿膜效应效果最佳(将此小肽命名为二硫环化FITC-PI),进一步体内外研究提示,二硫环化FITC-PI自身能够靶向定位于靶细胞,并表现出良好的载体特性。基于前期研究结果,本课题论文主要探讨二硫环化FITC-PI的靶向跨膜转移机制,揭示并定位MDA-MB-231和Calu-1细胞膜蛋白中介导二硫环化FITC-PI跨膜转运的特异性转导膜蛋白,分析此膜蛋白中与二硫环化FITC-PI跨膜转运功能密切相关的膜蛋白功能结构域,并进一步探索与二硫环化FITC-PI在胞浆内协同转运直接相关的胞浆蛋白及胞浆定位表达,为二硫环化FITC-PI应用于肿瘤靶向治疗及早期诊断方面提供实验依据。[方法]1.通过对人乳腺癌MDA-MB-231及人肺癌Calu-1细胞的各自20个STR位点及1个Amelogenin性别位点进行STR位点检测,与ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的对应细胞系进行比对,观察本实验室保存用于本实验的MDA-MB-231及Calu-1细胞无交叉污染后,人工合成标记FITC绿色荧光的二硫键环化FITC-PI。2.利用四种细胞膜非特异性通道抑制剂(包括氯丙嗪、制霉菌素、盐酸阿米洛利以及磷酸氯喹)分别阻断靶细胞膜上的巨胞饮、网格蛋白依赖途径、胞膜窖介导途径以及内涵体成熟介导非特异性内吞途径,检测阻断前后二硫环化FITC-PI在细胞中的表达,观察二硫环化FITC-PI是否可通过细胞膜上的非特异性穿膜机制发挥其穿膜效应。3.前期实验中我们发现二硫环化FITC-PI仅对MDA-MB-231和Calu-1细胞有特异性穿膜效应,因此,我们认为MDA-MB-231和Calu-1细胞膜上可能具有相同或类似的可协助二硫环化FITC-PI特异性穿膜的膜蛋白,因此,我们选择iTRAQ技术将MDA-MB-231及Calu-1细胞的全部胞膜蛋白进行分析及鉴定,我们选择人乳腺癌MCF-7细胞(前期实验中已证实二硫环化FITC-PI不能穿膜的细胞之一)全部膜蛋白数据作为对照,通过蛋白预测软件,筛选出与二硫环化FITC-PI特异性穿膜进入MDA-MB-231和Calu-1细胞的转运关键膜蛋白为SCAMP4蛋白,采用COMPARTMENTS数据库分析SCAMP4蛋白在细胞内的定位情况。通过RT-PCR及Western-blot检测SCAMP4蛋白是否存在于MDA-MB-231和Calu-1细胞并对其表达量进行分析。4.在证实SCAMP4蛋白在MDA-MB-231和Calu-1细胞真实存在后,我们进一步利用Label free法对于MDA-MB-231及Calu-1细胞的全部胞浆蛋白数据进行分析,随后采用string软件构建SCAMP4蛋白协助二硫环化FITC-PI穿膜进入细胞并在胞浆内的蛋白相互作用网络,将此蛋白互做网络中与SCAMP4蛋白发生作用的浆蛋白节点蛋白数据与MDA-MB-231及Calu-1中胞浆蛋白数据进行比对,完整绘制二硫环化FITC-PI在细胞膜蛋白SCAMP4蛋白协同下转运进入细胞后在细胞浆内转运信号网络。[结果]1.经过对MDA-MB-231以及Calu-1细胞的各自20个STR位点及1个Amelogenin性别位点进行STR位点检测,证实本实验所采用的MDA-MB-231及Calu-1细胞与ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN的对应细胞系为同一遗传背景来源的细胞,由此进行的细胞后续实验无误,具备可重复性。同时,本实验成功合成了二硫环化FITC-PI并对其进行鉴定。实验结果证实,重新优化并合成的二硫环化FITC-PI能够特异性的穿膜进入MDA-MB-231以及Calu-1细胞中。2.在非特异跨膜转运机制研究中,我们发现,二硫环化FITC-PI可通过直接转运方式穿膜进入MDA-MB-231以及Calu-1细胞。二硫环化FITC-PI可通过胞膜窖介导、巨胞饮介导以及干扰内涵体成熟的细胞内吞方式穿膜进入MDA-MB-231细胞,二硫环化FITC-PI可通过胞膜窖介导、巨胞饮介导的细胞内吞方式进入Calu-1细胞。3.分别提取MDA-MB-231、Calu-1及MCF-7细胞膜蛋白,通过iTRAQ技术将上述三株细胞的膜蛋白进行对比分析,研究结果发现:MDA-MB-231及Calu-1细胞(相对于MCF-7细胞)高表达或特有的(P0.05)膜上转运蛋白包括 B3KVN0,Q9ULF5,Q14332,B4DTS6,095864,P48509,SCAMP4,F8WDZ3,Q14114,B3KQX7。在 MDA-MB-231 及 Calu-1 细胞中都检测到但在MCF-7系中没有检测到的膜蛋白有HOY544,B7Z1M0,AOAOS2Z5F9,C9KOC8。利用Uniport蛋白数据库对上述膜蛋白的功能进行预测分析,我们发现,仅有SCAMP4是与蛋白转运特别是小肽跨膜转运密切相关的,提示:在MDA-MB-231及Calu-1细胞系中高表达而相对于MCF-7细胞中低表达的转运膜蛋白SCAMP4是与二硫环化FITC-PI特异性穿膜密切相关的。随后利用 COMPARTMENTS(Subcellular localization database)数据库针对SCAMP4的细胞膜定位分析,结果发现SCAMP4蛋白在细胞质膜上表达,同时,在高尔基体上也有较少表达。4.我们进一步利用Label free法对于MDA-MB-231及Calu-1细胞的全部胞浆蛋白数据进行分析及鉴定,随后采用string软件构建SCAMP4蛋白穿膜进入细胞并在胞浆内的蛋白相互作用网络,将此蛋白互做网络中与SCAMP4蛋白发生作用的浆蛋白节点蛋白数据与MDA-MB-231及Calu-1中胞浆蛋白数据进行比对,我们发现,能够与SCAMP4蛋白直接作用的而且存在于MDA-MB-231及Calu-1细胞中的胞浆蛋白为polyubiquitin C蛋白。因此,polyubiquitin C蛋白应该是SCAMP4蛋白转运外源性物质进入细胞后并导入胞浆的一个协同蛋白。此后,我们将SCAMP4蛋白的4个跨膜结构域序列与二硫环化FITC-PI的蛋白序列进行了同源性比对分析,结果发现,二硫环化FITC-PI与SCAMP4第一个跨膜区域的蛋白序列有重叠,提示二硫环化FITC-PI可能是通过与SCAMP4第一个跨膜区域特异性结合后跨膜进入细胞。[结论]1.本研究制备的二硫环化FITC-PI可通过直接转运方式穿膜进入人乳腺癌MDA-MB-231细胞及人肺癌Calu-1细胞:二硫环化FITC-PI可通过胞膜窖介导、巨胞饮介导以及干扰内涵体成熟的细胞内吞方式穿膜进入人乳腺癌MDA-MB-231细胞;二硫环化FITC-PI可通过胞膜窖介导、巨胞饮介导的细胞内吞方式穿膜人肺癌Calu-1细胞。2.本研究通过iTRAQ技术筛选得到与二硫环化FITC-PI特异性内化进入人乳腺癌细胞MDA-MB-231、人肺癌细胞Calu-1细胞的跨膜转运相关蛋白SCAMP4。SCAMP4蛋白是在人乳腺癌细胞MDA-MJB-231、人肺癌细胞Calu-1细胞系中高表达而相对于人乳腺癌细胞MCF-7中低表达的。3.SCAMP4蛋白是协助二硫环化FITC-PI穿膜进入MDA-MB-231及Calu-1的特异性膜蛋白,SCAMP4蛋白定位于细胞质膜上,SCAMP4蛋白的第一个跨膜区域与二硫环化FITC-PI穿膜有关。4.胞浆蛋白polyubiquitinC是胞膜蛋白SCAMP4在细胞内蛋白互作体。二硫环化 FITC-PI 穿膜进入 MDA-MB-231 与 Calu-1 细胞后,在 polyubiquitin C 协同下,二硫环化FITC-PI转运至胞浆中。
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【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】