多巴胺能神经元轴突变性在MPTP诱导的帕金森病模型中的作用研究

发布时间：2018-02-20 00:46

  本文关键词： 帕金森病 轴突变性 微管 发病机制　出处：《第四军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：帕金森病是一种目前发病率较高的中枢神经系统退行性疾病,近年来其发病率呈明显上升趋势,并且有年轻化发展的趋势,现有的流行病学调查显示其在50岁以上人群中的发病率约为1%。目前帕金森病的发病机制仍不明确,或许源于帕金森病患者脑组织内多巴胺水平的明显下降,中脑部位多巴胺神经元胞体的变性一直是帕金森病发病机制研究中的热点。但越来越多的研究却表明,相较于神经元胞体的变性及坏死,多巴胺能神经元轴突的损伤可能在帕金森病的发病中发挥了更为重要的作用。神经元的轴突变性是指外源性或者内源性的损伤因素作用于神经元或者轴突后轴突所表现出的损伤过程,如局部肿胀、轴突断裂等等,严重的轴突损伤会导致轴突内细胞骨架成分的崩解及连续性丧失。在既往的研究中,轴突损伤及变性并未被人们作为一个独立的过程而加以研究及对待,而是以神经元胞体损伤的伴随产物而加以研究,因此关于轴突损伤的报道局限于其是一种胞体损伤后的被动反应。然而随着研究的进一步发展,人们发现轴突变性不仅仅是一种被动的反应,更是轴突对损伤因素的一种主动反应过程,并且该过程会逆行性的影响到神经元胞体,因此,防止轴突变性在维护中枢神经系统的结构和功能的完整性上可能发挥了更为重要的作用。在帕金森病模型中,作为多巴胺能神经元轴突投射部位的纹状体,其损伤时间要明显早于中脑部位神经元胞体本身,且其损伤程度更甚。而作为一个独立的病理过程,轴突损伤的持续存在则会进一步逆行性加重胞体的损伤。因此轴突变性在帕金森病发病中的作用和地位可能需要重新审视。因此将多巴胺能神经元轴突变性作为一个新的突破口可能会对帕金森病发病机制的研究带来一个新的突破。第一部分:MPP+诱导的多巴胺能神经元轴突变性的研究目的:通过1-甲基-4-苯基-四氢吡啶离子(MPP+)对多巴胺能神经元的选择性的毒性作用,体外原代培养小鼠多巴胺能神经元,应用亚致死剂量MPP+持续作用于神经元,在离体实验中观察多巴胺能神经元轴突变性情况,并进一步探讨神经元胞体损伤与轴突变性的关系。方法:选择C57BL/6小鼠胚胎(孕14d)中脑腹侧组织进行多巴胺能神经元原代培养,。实验分为对照组及10.0μM MPP+药物实验组(亚致死剂量MPP+的浓度为预实验获得)。酪氨酸羟化酶(TH)可以选择性的标记多巴胺能神经元,因此本研究中采用TH染色对多巴胺能神经元进行标记。通过荧光显微镜及共聚焦显微镜对TH染色阳性神经元胞体的数量、突起数目和长度分别在1h、2h、4h、8h、12h、24h共6个时间点进行实验观察,应用TUNEL染色确定凋亡神经元,应用APP染色法进一步明确轴突损伤的情况。结果:在MPP+作用的早期(2h内),TH染色阳性神经元轴突开始出现了损伤表现,如轴突局部出现不规则膨大,顺应性变差,形态不规则等等,并且随药物作用时间的逐渐延长,荧光显微镜下可见TH染色阳性的神经元轴突交汇而成的网状交织密度开始逐渐下降,而轴突本身出现走形迂曲,变细缩短,甚至出现串珠样变,严重者轴突崩解,作用24h后,大部分神经元突起消失,部分仅残存突起根部,神经元胞体空虚形状不规则。对比对照组,在10μM MPP+作用后4h,神经元突起的数量开始下降(P0.05)并且损伤程度随作用时间而加重,24h后,突起的数量下降了71%;对比对照组,MPP+作用后12h内神经元胞体的形态无明显改变且数量无明显变化(P0.05),但24h后,神经元数量相较对照组下降了40%且胞体形状不规则。应用TUNEL染色示,2组相比较,MPP+作用后前12h内,二者凋亡细胞的数量并无明显统计学差异(P0.05);而随着MPP+作用时间的进一步延长(24h后),相较于对照组,MPP+处理组凋亡神经元的数量增加了29%。应用APP染色法观察轴突损伤可见,APP表达逐渐升高,且在初期其可见APP表达升高并在局部聚集。结论:亚致死剂量的MPP+作用于多巴胺能神经元,可避免大量的多巴胺能神经元在短期内大量的死亡,能够更好的的模拟临床上帕金森病发病的病理过程,在10μM亚致死剂量的MPP+作用下,多巴胺神经元突起的进行性损伤较神经元胞体损伤发生的更早且程度更为严重,这提示我们相较于胞体,神经元突起对外界的损伤因素更为敏感并且其可能作为一种对外界刺激做出的主动反应参与了神经元损伤的病理过程。第二部分:MPTP诱导的C57BL小鼠轴突损伤的研究目的:应用MPTP腹腔注射C57BL小鼠建立慢性帕金森模型。观察在此过程中小鼠中脑部位多巴胺能神经元胞体损伤的情况,及相应的纹状体投射部位的变化,探讨多巴胺能神经元轴突变性在帕金森病发病中的作用,同时进一步明确多巴胺能神经元胞体变性及轴突变性二者的关系。方法:大龄雄性C57BL小鼠110只,按照给药次数的不同随机分为11组(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10),每组10只。MPTP注射方法为腹腔注射30mg/kg,频次为3天一次。MPTP注射后12h,相应组别的小鼠被处死,行中脑及纹状体部位组织TH染色及FJC染色,观察TH染色阳性神经元胞体及轴突的损伤及变性情况;同时行透射电镜检查观察相应的超微结构变化。结果:第3次MPTP给药后,小鼠开始出现步姿不协调,行为缓慢等行为学改变,并且随着给药次数的增加而逐渐加重。TH染色结果示:正常对照组及第一次MPTP给药组,在SNc及VTA区域均观察到了TH-ir的细胞,其胞体饱满,轴突长且直,细胞排列整齐。第二次MPTP注射后,SNc部位的TH-ir细胞的突起开始变短变细并出现不规则的局部肿大,部分TH染色阳性轴突出现明显的串珠样改变,但其相对应的神经元胞体完整,形状规则,形态学观察未见明显异常。随着给药次数的增加,轴突损伤的程度进行性加重且出现胞体损伤。10次给药后,SNc部位仅有少量TH-ir细胞,且其突起基本上全部消失。定量结果显示纹状体部位TH-ir纤维相对光密度值(OD)自第二次给药后开始降低(P0.05)且随给药次数增加而进行性加重,而黑质致密部TH染色阳性细胞数量的下降则在发生时间上相对较晚,第四次MPTP注射后相较于对照组有统计学差异(P0.05)。10次MPTP注射后,相对于对照组,纹状体TH-ir纤维的OD值下降64%,同时SNc处TH-ir细胞数量下降47%。FJC染色示:第三次MPTP注射后在SNc处开始出现FJC-ir细胞,并且细胞数量随给药次数的增加而逐渐增多。FJC染色阳性神经元细胞在形态学上呈现出单一的胞体部分,而并未见明显的神经元突起,或仅残留有少量的突起根部。透射电镜示:在MPTP注射的早期,神经元胞体的超微结构并未出现明显的变化,但是其对应的轴突却出现了较为明显的超微结构的改变:如轴突呈现不规则的肿胀,内部的骨架结构出现结构紊乱甚至崩解消失等现象,并且随MPTP腹腔注射次数的增加,相应的轴突损伤的程度进一步加重,直至出现轴突断裂消失。结论:腹腔多次注射MPTP诱导的C57BL小鼠帕金森模型中,TH染色阳性轴突损伤在发生时间上要远早于胞体的损伤,而在损伤程度上,轴突的损伤则更为严重,因此这就提示轴突损伤可能是其对外界因素的一种独立反应,其在PD发病中的作用可能独立于胞体损伤之外并发挥了重要作用。第三部分:MPTP诱导的多巴胺能神经元轴突变性机制的研究目的:利用MPP+作用于原代培养的多巴胺能神经元细胞及MPTP腹腔注射诱导的C57BL小鼠慢性帕金森模型,利用细胞骨架带白β-TubulinⅢ的检测进一步定量轴突损伤,并揭示Akt/GSK-3β/CRMP-2信号通路是否参与了此过程,为PD的发病机制提供新的依据。方法:通过免疫印迹实验分析MPP+作用后,在不同时间点的Akt,GSK-3β及CRMP-2的表达及其磷酸化水平。应用western blot及免疫荧光染色分析β-TubulinⅢ的表达水平。为进一步明确Akt/GSK-3β/CRMP-2在轴突变性中的作用,在小鼠模型及体外培养的多巴胺能神经元中应用Akt的抑制剂LY294002,通过TH及FJC染色观察其对MPTP及MPP+对轴突损伤的作用,并通过western blot分析进一步分析Akt,GSK-3β及CRMP-2的表达及其磷酸化水平,应用western blot及免疫荧光染色分析β-TubulinⅢ的表达水平。结果:在亚致死浓度MPP+(10μM)作用下,p-Akt和p-GSK-3β在作用1h后出现明显下降,而在MPP+作用2小时,其二者的表达水平开始逐渐增高并于4 h达到最高峰,然后在8h,12h和24h再次下降。而p-CRMP-2在给药后1小时开始增加,2小时后下降并于4小时达到最低水平,8h,12h和24h较4h时表达升高但仍维持在较低水平。同时,在整个过程中,我们发现总Ak,GSK-3β及CRMP-2无显著变化。β-tubulin III在MPP+作用1小时后开始下降,且在整个24h的作用时间内持续性降低。应用Akt的阻断剂LY294002后,经过10次的MPTP和LY294002作用的C57BL小鼠其TH-ir神经元数量相较于MPTP组下降了约27%,而纹状体TH-ir纤维的OD值下降了35%。同时联合应用LY294002和MPTP给药十次后,SN部位的FJC-ir神经元较MPTP处理组显著增加(23%)。体外实验中,我们发现联合应用LY294002及MPP+增加了多巴胺能神经元轴突损伤的程度。作用4h后,和MPP+处理组相比,轴突的数量减少17%,而神经元的数量和对照组及MPP+相比并没有显着的变化相比。作用24小时后,相较于MPP+处理组,神经元的数量减少了22%,轴突的数量下降了15%。同时我们在联合应用MPP+及LY294002 4h的时间点测量了Akt,GSK-3β,CRMP-2及β-tubulin III的表达。我们发现,作用4h后,LY294002可以使p-Akt及p-GSK3β表达下降,同时使p-CRMP-2的表达增高,β-tubulin III的表达下降。结论:Akt/GSK-3β/CRMP-2通路参与了MPTP或MPP+诱导的轴突损伤过程,尤其损伤初期,可能参与了β-tubulin III的降解,但随着作用时间的增加,该通路进一步激活可能为细胞本身对于损伤的一种保护作用。
[Abstract]:Parkinson ' s disease is a kind of degenerative disease of the central nervous system with high incidence of Parkinson ' s disease . In the control group , the number of apoptotic neurons in the neurons of the positive neurons decreased by 40 % in the early stage of MPP + and the number of apoptotic cells increased by 29 % . The results showed that the number of neurons increased gradually after 24 h of MPP + . In the second part , we observed the changes of dopaminergic neuron axon degeneration in the pathogenesis of Parkinson ' s disease . Conclusion : In the early stage , the expression of p - crMP - 2 and p - GSK3尾 can be decreased , and the expression of p - CRMP - 2 is increased , and the expression of 尾 - cyclodextrin III is decreased . Conclusion : The pathway is more likely to be involved in the degradation of 尾 - cyclodextrin III during the early stage of injury , but the activation of the pathway may be a protective effect of the cell itself on injury as the action time increases .

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R742.5;R-332
，

本文编号：1518371