Ghrelin对放烧复合伤创面的促愈效应及机制研究

发布时间：2018-02-24 08:45

本文关键词： Ghrelin 放烧复合伤创面愈合肉芽组织机制研究　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：放烧复合伤(combined radiation-burn injury,CRBI)是指以放射损伤为主,同时或相继发生烧伤的一类放射复合伤。放烧复合伤属于军事特种医学的研究范畴,通常仅见于战现场或核事故,而罕见于日常生活。放射性损伤是其具有较大伤害性的首要原因,而烧伤的存在增加了病情的复杂性,常表现为“加重效应”。对于中度及以上的放烧复合伤,以“早期急性应激和休克、全身急性炎性反应、造血功能障碍、免疫抑制、胃肠道功能损伤及烧伤创面的延迟愈合及不愈合”为主的多种病理表现使治疗变得较为棘手。内外源性感染是引起死亡的主要原因,而烧伤创面的延迟愈合或不愈合则是不断加重的外源性感染的主要来源。因此,促进放烧复合伤创面愈合有助于延缓病情发展,并提高存活率和改善预后。目前对放烧复合伤的研究均限于动物水平,其中针对创面愈合的研究较少且缺乏系统性。这些物理(如创面护理、切痂等),化学(如碘伏和苯妥因等)或生物(如间充质干细胞等)治疗方法虽然在一定程度上改变了创面的愈合状态,但对动物整体伤情的减轻似乎并无突出贡献;某些方法不仅“性价比”低,还容易产生副作用,具有一定的应用局限性。Ghrelin是一种内源性多功能“脑-肠肽”,前期研究显示ghrelin可通过减弱急性应激反应,减轻急性炎性反应,促进造血功能恢复,降低放烧复合伤大鼠死亡率,可应用于放烧复合伤的综合治疗。Ghrelin具有合成容易、廉价易得、给药方便等优点,其对放烧复合伤动物的救治作用,除上述机制外,推测还可能与促进烧伤创面愈合有关。因此,本课题从以下几个层次研究了ghrelin促进放烧复合伤创面愈合的效应并探讨了其可能机制:第一部分,ghrelin对放烧复合伤创面的促愈效应观察,研究ghrelin促进创面愈合的整体效应。本部分主要设置3个组:正常组,放烧复合伤组和ghrelin治疗组。建立大鼠重度放烧复合伤模型(5Gy+10~15%TBSA[total body surface area]Ⅲ°烧伤),检测血清ghrelin水平的时相改变。Ghrelin采取颈后皮下(subcutaneously,s.c.)连续给药7天(24h×7d),ghrelin剂量为50nmol·kg-1·d-1,100 nmol·kg-1·d-1,200 nmol·kg-1·d-1,分别对应低、中、高剂量。伤后3,7,14d观察外周血红细胞(red blood cell,RBC),白细胞(white blood cell,WBC)和血小板(platelets,PLT)数量改变;伤后每隔2d记录大鼠体重改变情况,持续30d;每隔2d对创面进行照相,持续30d,最后对复合伤晚期创面面积进行估算,计算平均创面愈合率和创面闭合所需时间。第二部分,ghrelin促进放烧复合伤大鼠创面肉芽组织形成和成熟的研究。本部分实验主要分4个组:单纯烧伤组,放烧复合伤组,ghrelin治疗组,ghrelin受体阻滞剂预处理及ghrelin治疗组。照射剂量5Gy,6~8%TBSAⅢ°烧伤;受体阻滞剂[D-Lys3]-GHRP-6和ghrelin均采取颈后皮下给药,前者单次注射连续7d,剂量5mg·kg-1,先于ghrelin 6h给药,后者连续灌注7d,剂量200nmol·kg-1·d-1。伤后第10,20及30d提取各组大鼠创面肉芽组织,并执行如下实验操作:DNA、胶原、氨基己糖、硝酸盐和亚硝酸盐含量(即NO[nitric oxide]总含量)检测;胶原天狼猩红、Masson染色;新生血管免疫组化(immunological histological chemistry,IHC)染色;肉芽组织常规病理(haematoxylin-eosin,H.E.)染色;ghrelin受体(growth hormone secretagogue receptor1a,GHS-R1a)IHC染色;转化生长因子(transforming growth factor beta1,TGF-β1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的免疫印迹(western blot,WB)检测。这些指标主要评估微血管形成和胶原沉积情况,可直接反应肉芽组织成熟度和创面修复能力。第三部分,ghrelin促进放烧复合伤大鼠创面愈合的炎症机制研究。Ghrelin被公认有较好的抗炎特性,而放烧复合伤创面愈合程度与炎性反应程度高度相关,因此拟从炎症角度探讨ghrelin的促愈机制。由于放烧复合伤早期是炎性反应启动和变化的关键期,因此选择伤后1周作为该机制研究的时间范围。另外,因巨噬细胞在炎症的发生发展中扮演重要角色,故选择“量多易得”的腹腔巨噬细胞作为该机制研究的靶细胞。本部分实验分两个阶段进行递进研究。第一阶段实验主要设置3个组:正常组,复合伤组,ghrelin治疗组。照射剂量5Gy,10~15%TBSAⅢ°烧伤;ghrelin采取颈后皮下连续给药7d,剂量200 nmol·kg-1·d-1。伤后1,4,7d取血清用于促炎介质的酶联免疫检测(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA),包括肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和白介素6(IL-6)。同时获取前两组大鼠腹腔巨噬细胞,并提取总蛋白用于炎性信号通路相关蛋白磷酸化或总水平的WB检测,包括p38MAPK(p38 mitogen activated protein kinase)、JNK(jun N-terminal kinase)、ERK(extracellular signal-regulated kinase)和p65NF-κB(p65 nuclear transcription factor kappa B),及糖皮质激素(glucocorticoid,GC)抗炎途径中的糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR),并根据其表达变化情况选择最佳检测时相点。最后在此时相点上评价ghrelin对该类蛋白表达的影响。第二阶段实验主要设置8个组对“ghrelin可能通过干扰炎症途径促进创面愈合”的假说进行进一步的验证,包括正常组,复合伤组,ghrelin治疗组,p38MAPK阻滞剂(SB203580)处理组,JNK阻滞剂(SP600125)处理组,p38MAPK+JNK阻滞剂联合处理组,ghrelin受体阻滞剂([D-Lys3]-GHRP-6)处理组和TNF-α抗体(anti-TNF-αantibody)处理组。建模及ghrelin给药方法保持不变。SB203580和SP600125均采用颈后皮下连续给药7d,剂量15mg·kg-1·d-1;多克隆大鼠TNF-α抗体采取腹腔(intraperitoneally,i.p.)注射,剂量10mg·kg-1·d-1,2次/天,连续7d。在前面确定的时相点取血清进行TNF-α的含量检测,同时提取腹腔巨噬细胞总蛋白用于前述炎性信号蛋白的WB检测。此外,每隔2d照相记录各组大鼠创面愈合情况,为时1月,计算损伤晚期的平均创面愈合率和创面闭合所需时间。第四部分,ghrelin与TNF-α对放烧复合伤大鼠创面成纤维细胞相关生物学功能的影响及可能分子机制。成纤维细胞在肉芽组织成熟和创面修复过程中发挥重要作用,是关键的修复细胞;促炎介质如TNF-α可影响其正常的生物学功能(如分泌功能),从而阻碍创面愈合。在提取并培养复合伤大鼠皮肤肉芽组织成纤维细胞的基础上,依次进行了如下体外实验研究:免疫细胞染色(immunocytochemistry,ICC)观察饥饿素受体GHS-R1a,平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)分别在成纤维细胞膜及胞浆内的表达情况;ghrelin、TNF-α单独及联合给药对原代成纤维细胞增殖活性的影响;“划痕”实验评价ghrelin的“促迁移”能力;TNF-α、TGF-β单独作用对细胞内Smad3蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein,type 3)磷酸化水平的影响,确定检测Smad3的最佳时间点;ghrelin和TGF-β联合作用对Smad3磷酸化的影响;ghrelin、TNF-α及TGF-β三者对细胞内p38MAPK,JNK和Smad3磷酸化水平的共同影响及相互关系。此部分旨在初步探索ghrelin是否能够促进成纤维细胞分泌胶原,从而进一步在细胞及分子层面上解释其促愈作用。以上4个部分的研究内容均涵盖了ghrelin在“动物—组织—细胞—分子”各个层面上对放烧复合伤大鼠创面愈合的贡献作用,主要表现为与创面愈合相关的炎症机制研究。获得的主要研究结果如下:1.放烧复合伤导致大鼠血清ghrelin浓度显著下降,伤后第7d最为明显(下降约50%),之后逐步恢复至正常水平。50,100和200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗组大鼠在伤后24d的平均创面愈合率分别约为60%,50%和30%(与单纯复合伤组比较,P0.05);同时也缩短了创面闭合所需平均时间约3~8d(与单纯复合伤组比较,P0.05)。体重影响方面,200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗还可促进复合伤大鼠体重增加,最高可达5%(约11g)。造血方面,在伤后3,7,14d,200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗显著抑制了WBC和PLT数目的减少(与单纯复合伤组比较,P0.05)。2.各实验组大鼠创面肉芽组织内DNA、胶原(羟脯氨酸)、氨基己糖和总NO含量,随着创面的逐渐修复,均呈现出先增加后减少的变化趋势;在检测时间点内,伤后第20d为含量变化最高点。与单纯烧伤组比较,复合伤组肉芽组织内DNA、胶原、氨基己糖和总NO含量均有显著降低(P0.05),而200nmol·kg-1·d-1ghrelin治疗组在相应时间点均显著促进了以上各项指标的提升(与复合伤组比较,P0.05):DNA含量在复合伤后10,20和30天分别下降约67%,56%和63%,ghrelin分别提高了其含量约138%,98%和136%;胶原含量在伤后第10,20d分别下降约36%和32%,ghrelin均提高了其含量约36%;氨基己糖含量在伤后第10,20d分别下降约34%和36%,ghrelin提高其含量约26%和46%;总NO含量在第10,20d分别下降约77%和50%,ghrelin提高其含量约200%和33%。胶原天狼猩红和Masson染色也显示复合伤肉芽组织内胶原含量明显低于单烧组,而ghrelin治疗后其分泌水平明显升高(P0.05);血管染色显示复合伤肉芽组织内血管形成数量明显减少,而ghrelin治疗则提高了微血管数量(P0.05)。WB实验证实生长因子TGF-β和VEGF分泌水平也出现类似“倒三角”变化趋势。其次,H.E.染色结果发现复合伤肉芽组织内WBC浸润量明显低于单烧组,而ghrelin治疗组WBC数目明显增加,主要以中性粒细胞和单核细胞为主。另外,通过对GHS-R1a进行染色发现,其在复合伤肉芽组织内表达量明显降低,而ghrelin可相对上调GHS-R1a表达。阻滞剂[D-Lys3]-GHRP-6的使用极大程度地削弱或抑制了ghrelin的上述效应。3.放烧复合伤大鼠血清中促炎介质TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌水平在各个时间点均明显升高(与正常组比较,P0.05),ghrelin治疗发挥了显著的抑制作用(与复合伤组比较,P0.05)。炎症因子TNF-α是影响创面愈合的重要因素之一,伤后1,4,7d复合伤大鼠血清TNF-α浓度分别约是正常对照组的6,24和42倍(P0.05),ghrelin治疗后第4,7d分别下降至原浓度的46%和61%(P0.05)。炎性信号分子检测方面,通过WB对各组大鼠腹腔巨噬细胞总蛋白进行分析发现:伤后第4天p38MAPK,JNK和p65NF-κB有最为显著的磷酸化增强,相反GR的表达则明显下调,ghrelin治疗后前三者磷酸化明显减弱,GR表达则显著上调。通过使用相应的蛋白抑制剂,在同一时间点发现:SB203580或SP600125单独使用可分别抑制p38MAPK、JNK的磷酸化,而联合使用则可同时抑制p38MAPK和JNK的磷酸化;SB203580,SB203580+SP600125均可阻碍p65NF-κB的磷酸化激活,而二者的单独或联合使用均可使GR表达明显增加,联合使用效果更好;Anti-TNF-α处理可明显抑制p38MAPK、JNK和p65NF-κB的磷酸化激活,上调GR表达,效果类似但不及ghrelin;在同一时间点ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α还显著降低了复合伤大鼠血清中TNF-α的分泌水平。创面愈合相关指标显示,ghrelin、SB203580、SB203580+SP600125和anti-TNF-α在伤后第24天均表现出更高的平均创面愈合率(35%~65%,P0.05),且缩短了平均创面闭合所需时间(3~8d,P0.05),但以ghrelin效果最佳。[D-Lys3]-GHRP-6的使用几乎完全抑制了ghrelin的上述作用。4.GHS-R1a和α-SMA分别在复合伤大鼠创面成纤维细胞膜及胞浆内均有高水平表达,且分布均匀。增殖活性评价方面,不同剂量的Rat ghrelin(1-104ng/mL)均未能提高原代成纤维细胞的增殖能力;不同剂量的Rat TNF-α(1-100ng/mL)未能诱发细胞凋亡,细胞存活率无明显改变;ghrelin和TNF-α联合作用对其增殖活性亦无明显影响。“划痕实验”也显示,1-104ng/mL的ghrelin均不能促进“划痕”的愈合。在ghrelin的“促胶原分泌”相关机制研究方面,发现以下现象:TGF-β(5ng/m L)可使成纤维细胞内Smad3的磷酸化在刺激后0.5-1h显著增强(P0.05),而TNF-α(5ng/m L)则可致Smad3的磷酸化在刺激后1-2h显著减弱(P0.05);ghrelin(1、100ng/mL)对TGF-β所致Smad3磷酸化的增强无影响;TNF-α引起成纤维细胞内p38MAPK和JNK的磷酸化水平显著增加(P0.05),Smad3的磷酸化水平明显降低,而经ghrelin处理后p38MAPK和JNK的磷酸化受到明显抑制,反之Smad3的磷酸化水平则又有所恢复。综上所述,ghrelin可加快放烧复合伤大鼠创面肉芽组织成熟从而剂量依赖性地促进创面愈合,其可能机制主要是:改善造血功能,增加肉芽组织WBC浸润及相关生长因子分泌,促进新生血管形成和胶原沉积;抑制MAPK炎性信号通路,促进GR表达或活化,减少炎性细胞促炎介质分泌,进而减弱全身炎性反应;抑制MAPK炎性信号通路,增强Smad3磷酸化,减轻TNF-α对创面成纤维细胞胶原分泌活性的抑制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R82

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