罗格列酮对APAP急性肝损伤的保护作用及机制

发布时间：2018-03-02 11:14

  本文选题：对乙酰氨基酚　切入点：药物性肝损伤　出处：《安徽医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景与目的药物性肝损伤(drug induced liver injury,DILI)严重威胁患者用药后的生命安全。对乙酰氨基酚(acetaminophen,APAP)是临床常用的消炎镇痛药物,在过量使用时可引起急性肝衰竭甚至死亡。APAP造成肝损伤的机制可能有炎症反应、氧化应激、线粒体自噬、内质网应激等机制。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptors,PPARγ)具有调节脂质代谢、调节免疫、抗肿瘤等生理功能,对多种因素引起的肝损伤具有保护作用。噻唑烷二酮类药物(troglitazone,TZDs)是PPARγ的配体,可以与PPARγ结合并激活PPARγ信号通路。已有多篇文献报道,PPARγ激动剂罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)具有抗炎及抗氧化应激的作用,但RSG是否可以减轻APAP急性肝损伤时的炎症及氧化应激反应尚不清楚。本研究拟在建立APAP诱导急性肝损伤动物模型的基础上,观察RSG对APAP诱导急性肝损伤的保护作用,并从炎症反应、氧化应激机制方面初步探讨RSG对APAP急性肝损伤保护作用的机理。方法1.为观察RSG对APAP急性肝损伤的保护作用,随机将健康雄性CD-1小鼠分成10组,每组6只,共60只。正常对照组:正常饲养,在APAP组给药的同时用生理盐水腹腔注射;单纯RSG组:在APAP组给药前48h、24h及1h分别予以RSG(20mg/kg)灌胃,在APAP组给药的同时给予等容积的生理盐水腹腔内注射;APAP组(4组,分别为APAP 0h组、APAP 1h组、APAP 4h组及APAP 24h组):单次给予APAP(300mg/Kg)腹腔注射;RSG+APAP组(4组,即RSG+APAP 0h组、RSG+APA P1h组、RSG+APAP 4h组及RSG+APAP 24h组):在腹腔注射APAP前48 h、24h和1h予以RSG(20mg/kg)各灌胃一次。APAP组及RSG+APAP组分别在APAP给药后0h、1h、4h、24h剖杀小鼠。所有小鼠在APAP给药前禁食12 h。收集血清检测ALT、AST、CRP和TBIL水平;部分肝脏组织行HE病理检查及凋亡检测。2.为研究RSG对APAP诱导的急性肝损伤小鼠生存率的影响,随机将小鼠分为两组,每组10只。APAP组及RSG+APAP组处理方法同方法1。观察两组小鼠在1周内每天的生存个数,绘制生存曲线。3.为观察RSG对APAPⅠ相代谢酶CYP2E1的影响,随机将小鼠分成4组,每组6只,即正常对照组、RSG组、APAP组、RSG+APAP组,处理方法同方法1,在APAP处理后0.5h剖杀各组小鼠,取肝脏组织用Western blotting法检测CYP2E1的表达。4.为观察RSG对APAP急性肝损伤的肝脏组织GSH代谢酶活性的影响,随机将小鼠分成4组,每组6只,共24只,即正常对照组、RSG组、APAP组、RSG+APAP组,处理方法同方法1,在APAP给药后1h剖杀各组小鼠,取新鲜肝组织检测谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GSH-Rd)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的酶活性。结果1.RSG对APAP急性肝损伤的保护作用从APAP给药后1h开始,血清ALT、AST水平即进行性升高。血清TBIL水平从APAP处理后4h开始进行性升高。RSG预处理后,血清ALT、AST及TBIL水平较同时段单纯APAP组有不同程度的降低。HE染色结果显示,在APAP 1h组,肝脏开始出现淤血水肿;APAP4h组有明显的肝细胞点状坏死、桥接坏死及亚大块坏死;在APAP 24h组出现明显的大块状坏死。用TUNEL技术检查发现,在APAP 1h组,可见有少许肝胞凋亡;APAP 4h组,其凋亡阳性细胞数则明显增加,在24h达到最高峰。RSG预处理的APAP组,肝细胞的变性、坏死程度及坏死面积均较同时段单纯APAP组轻,且凋亡阳性细胞数也明显低于同时段单纯APAP组。单纯APAP组小鼠7日生存率为50%,明显低于RSG预处理组(80%)。3.RSG对APAPⅠ相代谢酶CYP2E1的代谢的影响APAP急性肝损伤时CYP2E1的表达并未发生明显变化,RSG也不影响急性APAP急性肝损伤时的CYP2E1的表达。4.RSG对APAP急性肝损伤炎症反应的影响4.1 RSG对APAP急性肝损伤模型的血清C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)的影响与对照组相比,APAP组在4h后血清CRP表达开始轻度升高,在24h达高峰;用RSG预处理可以降低APAP造成的CRP升高水平。4.2 RSG对APAP急性肝损伤时有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响用Western-blotting技术,对MAPK亚家族成员JNK、ERK1/2、P38MAPK及AKT的磷酸化水平进行观察。结果提示,APAP急性肝损伤过程中,上述4种MAPK家族分子均被磷酸化激活。而使用RSG预处理,可以明显下调APAP诱导的上述分子的磷酸化水平。4.3 RSG对APAP急性肝损伤时NF-κB的信号通路的影响用Western blotting技术检测发现,在APAP给药后1h,细胞核内的P65和P50表达增加,并且进行性升高至24h。表明NF-κB在APAP给药后早期即被激活。使用RSG预处理,可以明显下调NF-κB的核表达。4.4 RSG对APAP急性肝损伤时炎性相关因子表达的影响用RT-PCR的方法观察RSG对APAP急性肝损伤时TNFα、KC、COX-2等炎性因子或趋化因子表达的影响。结果发现,与对照组相比,APAP组在出现肝损伤时,细胞因子TNFα、KC的m RNA水平明显增加,而RSG预处理的APAP组,TNFα、KC的m RNA水平明显低于同时段的APAP组。而各组COX-2的转录情况并没有明显差别。5.RSG对APAP诱导肝损伤氧化应激通路的影响5.1 RSG可以减轻APAP导致的还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)耗竭2.RSG对APAP诱导的急性肝损伤小鼠生存率的影响在APAP1h组,其肝脏组织中的GSH处于耗竭状态;在APAP4h组,其肝组织中GSH含量较APAP1h组有所上升;在APAP 24h组,GSH几乎恢复至对照组水平。在RSG+APAP 1h组,GSH水平明显高于单纯APAP组;而在RSG+APAP 4h及RSG+APAP 24h组,其肝脏GSH含量与正常对照组无明显差别。5.2 RSG对APAP急性肝损伤的肝脏组织GSH代谢酶活性的影响APAP过量可导致GST、GSH-Rd、GSH-Px三种代谢酶活性降低,RSG可以改善由APAP造成的GSH-Rd的活性减低,对于GST及GSH-Px活降低也有一定的恢复作用,但无明显的统计学意义。5.3 RSG对APAP急性肝损伤脂质过氧化产物表达的影响将肝脏组织进行匀浆后,测定丙二醛(malonaldehyde,MDA)含量。结果发现,在APAP肝损伤早期(1h)即有MDA含量的明显升高;而在4h后MDA含量及正常组无明显的变化,而使用RSG预处理组各时段其MDA含量均未见明显升高。5.4 RSG对APAP急性肝损伤肝脏组织3硝基酪氨酸(3NT)的影响采用Western blotting技术检测提示,从APAP给药后1h开始,3NT的表达呈进行性增加。而RSG预处理可以明显降低APAP急性肝损伤组织的3NT表达。5.5 RSG对APAP急性肝损伤肝脏组织NADPH氧化酶(NADPH xidase,NOX)表达的影响用Western blotting技术检测发现,从APAP给药后1h开始,NOX-2及NOX-4的表达呈进行性升高,并且与肝损伤的程度相一致。而RSG预处理可以明显降低APAP给药后NOX-2及NOX-4的表达。结论综合以上实验结果,可以得出以下结论:1.RSG对APAP急性肝损伤具有保护作用;2.RSG可能通过抑制炎症反应而发挥其对APAP急性肝损伤的保护作用;3.RSG对APAP急性肝损伤的保护作用可能与抑制氧化应激反应有关。
[Abstract]:Background and purpose of drug-induced liver injury (drug induced liver injury, DILI) treatment in patients with serious threat to life safety. After acetaminophen (acetaminophen, APAP) is a commonly used anti-inflammatory analgesic drugs, the excessive use can cause the mechanism of acute liver failure and even death.APAP caused liver injury may have inflammation, oxidation stress, mitochondrial autophagy, endoplasmic reticulum stress. The mechanism of peroxisome proliferator activated receptor gamma (peroxisome proliferator activated receptors, PPAR y) could regulate lipid metabolism, immune regulation, anti-tumor and other physiological functions, has a protective effect on liver injury caused by many factors. Two thiazolidinediones (troglitazone, TZDs) is a ligand PPAR gamma, and PPAR gamma combined activation of PPAR signal pathway of gamma. There are many reports, PPAR agonist rosiglitazone (Rosiglitazone, RSG) has anti-inflammatory and The role of oxidative stress, but whether RSG can reduce oxidative stress and inflammation in acute liver injury of APAP is not clear. This study based on the establishment of animal model of acute liver injury induced by APAP on the protection effects of RSG on APAP induced acute liver injury, and the inflammatory reaction, oxidative stress mechanism to explore the mechanism of protective effect of RSG on APAP induced acute liver injury. Methods 1. in order to observe the protective effect of RSG on APAP induced acute liver injury, random healthy male CD-1 mice were divided into 10 groups, 6 rats in each group, a total of 60. Normal control group: normal diet, medication in group APAP and saline intraperitoneal injection; RSG group: before administration of 48h in group APAP, 24h and 1H respectively to RSG (20mg/kg) by intragastric administration, given saline intraperitoneal injection volume in the APAP group; APAP group (Group 4, APAP respectively in 0h group, APAP 1H group, APAP group and APA 4H P 24h缁，

本文编号：1556282