补肾活血化痰法对秀丽线虫抗氧化及Aβ蛋白毒性作用研究

发布时间：2018-03-04 18:43

本文选题：补肾活血化痰　切入点：Aβ毒性　出处：《湖北中医药大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:本论文从补肾活血化痰法的文献探讨出发,梳理其基本概念和理论渊源,从而分析补肾活血化痰法对衰老及老年性痴呆的影响,同时整理并归纳分析了有关阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,简称AD,老年痴呆症的主要类型)病理过程中Aβ(amyloid-βpeptide)蛋白聚积毒性与氧化损伤之间关系的相关文献。在此基础上,从导师科研团队前期研究基础出发,以衰老和老年性痴呆为切入点,选用补肾名方六味地黄丸作为补肾法代表方,通过与化痰法代表方二陈汤、活血法代表药三七配伍进行研究,分为六味地黄丸加三七(简称补肾活血组)、六味地黄丸加二陈汤(简称补肾化痰组)、六味地黄丸加二陈汤和三七(简称补肾活血化痰组)等处理组,以秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)野生型(N2)和转基因AD模型(CL4176)为研究对象,通过氧化水平调节、Aβ蛋白毒性缓解、衰老相关基因调控等方面的分析,阐释补肾活血化痰法对防治痴呆和延缓衰老的作用机制,同时为抗AD药物的研发奠定基础。方法:1.理论探讨:整理补肾活血化痰治法对衰老和痴呆作用的文献,并探讨现代研究补肾活血化痰药的抗氧化作用与缓解Aβ蛋白毒性作用之间的关系,从而评价补肾活血化痰法对AD和衰老的作用,并初步判断其作用机制。2.实验研究:分别选用N2(野生型)和CL4176(转基因AD模型)秀丽线虫为动物模型进行相关实验研究。其中,CL4176秀丽线虫因其肌肉细胞中Aβ的表达在表型上出现抽搐症状,同时具有AD相关症状和病理变化。本论文首先进行了瘫痪缓解实验,以此筛选具有缓解Aβ毒性作用的活性药物组及药物有效浓度。同时,通过百草枯氧化胁迫实验,筛选出具有抗氧化作用的药物组及有效浓度。然后通过比较分析药物抗氧化作用与缓解Aβ毒性之间的关系,确定具有抗氧化且能缓解Aβ毒性的活性药物组及其有效浓度。在此基础上进一步开展了以下系列实验:寿命、热应激、繁殖能力、运动能力等衰老相关实验,以分析活性药物对衰老的影响;活性氧(ROS)水平、SOD和CAT等抗氧化酶活性以及丙二醛(MDA)含量测定,以探讨活性药物对氧化应激的影响;通过荧光定量PCR对氧化应激相关基因skn-1/Nrf2以及热休克蛋白家族基因hsp16.2和hsp60等进行分析,以探讨药物防治AD及延缓衰老的作用机制;采用硫磺素T(Th T)染色法进行Aβ蛋白体外聚集实验,以检测药物对Aβ蛋白聚集的作用。通过以上实验,探讨补肾活血化痰法对于AD作用机制及其与寿命影响之间的可能关系。结果:1.对秀丽线虫体内Aβ毒性作用的影响:药物对秀丽线虫瘫痪缓解程度可以反映药物对秀丽线虫Aβ毒性的作用。通过诱导瘫痪后对秀丽线虫进行计数和分析,发现补肾组、补肾活血组、补肾化痰组和补肾活血化痰组均具有缓解Aβ蛋白毒性的作用,其中补肾组、补肾活血组和补肾化痰组有效作用的最佳浓度均为50 mg/ml,补肾活血化痰组有效作用的最佳浓度为100 mg/ml。通过进一步对四种治法缓解Aβ毒性的效果进行比较分析,发现补肾活血组缓解效果最明显,其余依次为补肾活血化痰组、补肾化痰组和补肾组。因本实验在固体培养基上开展,因此所获得的最佳药物浓度为后续固体培养法的实验浓度。2.对秀丽线虫抗氧化能力的影响:抗氧化相关实验包括百草枯氧化胁迫实验、体内ROS水平、SOD和CAT活性以及MDA含量等的检测。通过百草枯氧化胁迫造模,观察抗氧化损伤后秀丽线虫存活时间来反映药物的抗氧化能力。实验结果显示,与空白组比较,药物组均能明显提高秀丽线虫在百草枯胁迫下的存活能力,补肾组最佳有效浓度为40mg/ml,补肾活血组为60mg/ml,补肾化痰组为0-100h内最佳浓度为40mg/ml,100h以后为60mg/ml,补肾活血化痰组为60mg/ml,将筛选浓度后的各组方最佳浓度再次进行氧化胁迫实验,得到结果显示,在0-120h内,以补肾活血化痰组效果最佳,120h以后补肾活血组效果最佳,其次为补肾化痰组和补肾组,此实验以液体培养进行,因此所确定的有效浓度为液体培养法浓度。通过ROS水平检测,发现各组药物均可显著降低秀丽线虫体内的ROS水平,其中补肾活血组ROS水平最低,其次为补肾活血化痰组、补肾化痰组,补肾组效果较其他药物组ROS水平低,因此,药物抗氧化作用效果由大到小依次为补肾活血组、补肾活血化痰组、补肾化痰组和补肾组;相比于空白对照组,补肾组及其他药物组均能显著增强氧化胁迫造模后秀丽线虫体内SOD活力,其中以补肾活血组SOD活力最为明显(p0.01),其次为补肾活血化痰组(p0.05)、补肾化痰组(p0.05)、补肾组(p0.05)。CAT活力最强为补肾活血化痰组(p0.05),其次为补肾活血组(p0.05)、补肾化痰组(p0.05)、补肾组(p0.05)。对比空白组,补肾活血化痰组能显著降低氧化胁迫下秀丽线虫体内的MDA含量(p0.01),其次为补肾化痰组(p0.05)、补肾活血组(p0.05)。补肾组结果显示MDA含量无明显降低。补肾活血化痰法可通过抗氧化损伤,缓解Aβ毒性,保护神经元,体现了补肾活血化痰法在对抗秀丽线虫Aβ毒性作用过程中发挥了主要作用。3.对秀丽线虫寿命的影响:寿命相关实验包括固体寿命实验、热应激实验、繁殖力实验、运动能力实验等。寿命实验中药物为瘫痪缓解实验所筛选出的最佳浓度,补肾组、补肾化痰组和补肾活血组浓度取50mg/ml,补肾活血化痰组浓度取100mg/ml,寿命实验结果,与空白组寿命周期比较,各药物组均能显著延长秀丽线虫的平均寿命,其空白组平均寿命为18.975±0.175天,补肾组平均寿命为21.842±0.190天(p0.05),补肾活血组平均寿命为22.943±0.194天(p0.05),补肾活血化痰组平均寿命为25.651±0.106天(p0.001),结果均具有统计学意义。四种治法延缓衰老的效果进行综合比较,补肾活血化痰组抗衰效果最佳,其次为补肾活血组,其次补肾化痰组,最后为补肾组;热应激实验结果,与空白组比较,各药物组均可延长秀丽线虫热应激时平均存活时间,其中补肾化痰组抗热应激效果最佳,差异有统计学意义(P0.001),热应激效果其他药物组依次为补肾活血组、补肾组、补肾化痰组,差异有统计学意义(P0.05);繁殖力实验结果,生殖高峰期子代数目,空白组为168.7±25.2条,补肾组(50mg/ml)为244.7±22.8条(p0.001),补肾活血组为280.6±20.7条(p0.001),补肾化痰组235.7±19.1条(p0.001),补肾活血化痰组为274.7±20.5条(p0.001),对比于空白组,各药物组均明显提高秀丽线虫生殖能力(P0.01),其中补肾活血组作用更为显著,其他药物效果依次为补肾活血化痰组、补肾组、补肾化痰组,差异有显著统计学意义;运动能力实验结果,身体弯曲次数最多为补肾活血组,表明补肾活血法对运动能力的影响明显优于其他组,其次为补肾活血化痰组、补肾组,和补肾化痰组。4.补肾活血化痰法对抗氧化基因、主要热休克蛋白家族基因的影响以Real-Time PCR的2-△△CT值表示相关基因在秀丽线虫体内的m RNA的相对表达水平。各药物组结果,与act-1 m RNA相比,skn-1 m RNA水平明显上调,表明补肾活血化痰法缓解秀丽线虫Aβ毒性作用机制可能与skn-1/Nrf2抗氧化作用途径有关。使用RT-PCR的方法进一步探究了药物对于主要热休克蛋白家族基因表达情况的影响,主要研究了热休克蛋白家族代表如hsp-16.2、hsp-60基因的表达情况,结果显示AD模型线虫体内,补肾活血化痰法对热休克蛋白基因hsp-16.2 m RNA、hsp-60 m RNA表达未见明显上调或下调。5.补肾活血化痰法对Aβ蛋白体外聚集的影响结果显示,药物与Aβ一起孵育,但并不影响Aβ蛋白体外聚集过程,因此结果表明,补肾活血化痰法对线虫体内Aβ的清除作用不是通过直接竞争性结合Aβ蛋白单体实现的,而很可能是通过与体内某些应激压力作用有关。结论:1.补肾活血化痰法对于延缓Aβ毒性及延缓寿命均具有显著作用,其治疗作用明显优于补肾法、补肾活血及补肾化痰法,抗氧化作用则以补肾活血法最为显著。2.对缓解Aβ毒性作用有效的药物多具有抗氧化活性,且对于寿命均有一定程度的延长作用,说明抗AD作用的药物对健康寿命具有积极促进作用。3.补肾活血化痰法作用于AD秀丽线虫主要是通过体内抗氧化应激作用,且此作用具有延缓衰老、提高抗氧化酶活性等作用。4.补肾活血化痰法缓解Aβ蛋白毒性作用机制,不是通过调控热休克蛋白家族基因或竞争性结合而改变Aβ蛋白空间构象来发挥作用,很可能与skn-1/Nrf2介导的抗氧化作用机制相关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【相似文献】