内质网应激-CHOP-CaMKⅡ通路介导分子氢心肌保护作用的实验研究

发布时间：2018-03-05 00:23

本文选题：氢　切入点：内质网应激　出处：《第二军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：一、研究背景心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,IR)使心肌细胞凋亡增加,导致再灌注后心功能不全,是制约心血管手术临床疗效的重要因素。如何有效地降低IR后心肌细胞凋亡,减少心肌损伤,保护心功能,一直都是心血管领域基础和临床研究的热点。近来研究发现,心肌IR时会引起严重的氧化应激,产生大量活性氧簇(reactive oxygen species,ROS),触发内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS),诱发氧化型钙/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(ox-Ca~(2+)/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ,ox-CaMKⅡ)激活,导致心肌细胞凋亡。心肌IR发生时,CaMKⅡ能够介导细胞内Ca~(2+)超载而加重心肌IR损伤。晚近有学者发现新型气体分子氢(Hydrogen,H_2)可以在IR中选择性抗氧化而发挥保护作用。我们推测,H_2可能通过减少心肌IR后ROS的产生,调节ERS,降低CaMKⅡ的活化,减少细胞Ca~(2+)([Ca~(2+)]i),维持细胞内钙稳态,从而抑制心肌细胞凋亡,发挥保护心功能的作用。二、研究目的1、明确分子氢在心肌IR损伤中的心肌保护作用;2、阐明分子氢在心肌IR中保护心肌的分子机制。三、研究方法(一)H_2调节ERS影响细胞凋亡的实验研究乳鼠心肌细胞先经低氧(1%氧气+5%二氧化碳+94%氮气)培养30min,然后正常(5%二氧化碳+95%空气)培养120min,以建立细胞缺氧复氧(hypoxia/reoxygenation,HR)模型。实验用细胞随机分为3组:Con组、HR组和H_2组(先使用0.6m M富氢DMEM培养基培养30min,再进行HR)。采用CCK-8测定心肌细胞活力,二硝基苯肼比色法测定培养液上清中LDH含量,ELISA法测定培养液上清中cTnI含量,流式细胞仪测定细胞凋亡率,以及Western blot检测CHOP、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。(二)H_2调节ERS-CaMKⅡ-Ca~(2+)超载影响细胞凋亡机制研究1、CHOP介导H_2影响CaMKⅡ氧化激活的研究构建大鼠CHOP基因过表达慢病毒载体(Lv-CHOP)和CHOP基因短发卡RNA(sh RNA)慢病毒载体(Lv-sh RNA),分别转染乳鼠离体心肌细胞以上调或下调CHOP的表达水平。采用与第1部分相同方法构建离体细胞HR模型。实验用细胞随机分为7组:Con组、HR组、H_2组、HR+Lv-CHOP组(采用Lv-CHOP转染的细胞,处理同HR组)、HR+Lv-CHOP+H_2组(采用Lv-CHOP转染的细胞,处理同H_2组)、HR+Lv-sh RNA组(采用Lv-sh RNA转染的细胞,处理同HR组)和HR+Lv-sh RNA+H_2组(采用Lv-sh RNA转染的细胞,处理同H_2组)。采用Western blot检测ox-CaMKⅡ和CaMKⅡ蛋白的表达水平。2、CaMKⅡ介导H_2影响细胞内Ca~(2+)超载的研究同第1部分方法建立离体心肌细胞HR模型,使用KN-93特异性阻滞CaMKⅡ激活。实验用细胞随机分成5组:Con组、HR组、H_2组、HR+KN-93组(细胞先在含2μM KN-93的DMEM培养基中培养30min,后处理同HR组)和HR+H_2+KN-93组(细胞先在含2μM KN-93的富氢DMEM培养基中培养30min,后处理同HR组)。采用流式细胞仪检测细胞内Ca~(2+)([Ca~(2+)]i)和细胞凋亡率,以及Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。(三)H_2调节ERS影响细胞凋亡的在体验证研究通过结扎冠状动脉左前降支缺血30min,随后再通恢复灌注120min建立大鼠心肌IR模型。30只SD大鼠随机分为3组:Sham组(只进行开胸手术)、IR组和H_2组(再灌注前5min给予腹腔注射10m L/kg富氢生理盐水)。再灌注后120min测定大鼠的左心室收缩压(LVSP)和左心室等容收缩期压力最大变化速率(+dp/dtmax),Evans-Blue/TCC双染色测定心肌梗死面积。采用免疫组织化学法测定心肌中8-OHd G和3-NT的阳性表达指数,二硝基苯肼比色法测定血清中LDH含量,ELISA测定血清中c Tn I含量,TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,以及Western blot检测CHOP、ox-CaMKⅡ、CaMKⅡ、Bcl-2、Bax蛋白表达水平。四、研究结果(一)H_2调节ERS影响细胞凋亡的实验研究1、H_2改善心肌细胞HR后细胞活力各组心肌细胞的细胞活力分别为:Con 98.8±1.0%,HR 32.6±5.2%,H_2 59.3±3.9%,其中H_2组显著高于HR组(P0.001),提示H_2可改善心肌细胞HR后细胞活力。2、H_2减少心肌细胞HR后损伤各组心肌细胞培养液上清中LDH含量分别为:Con 12.2±1.7 U/L,HR 24.7±3.1U/L,H_2 19.3±2.9 U/L,其中H_2组显著低于HR组(P=0.047);各组培养液上清中c Tn I含量分别为:Con 68.2±8.8 ng/L,HR 127.8±16.6 ng/L,H_2 95.7±7.6 ng/L,其中H_2组显著低于HR组(P=0.015),提示H_2可减少心肌细胞HR后损伤。3、H_2减少心肌细胞HR后细胞凋亡与Con组相比,HR组Bcl-2/Bax比值显著降低(P0.001),而H_2组Bcl-2/Bax比值显著高于HR组(P0.001),提示H_2在心肌细胞HR后可通过升高Bcl-2/Bax比值而减少细胞凋亡。各组心肌细胞凋亡率分别为:Con 7.7±1.6%,HR 87.7±9.0%,H_2 68.9±9.6%,其中H_2组显著低于HR组(P=0.024),提示H_2可减少心肌细胞HR后细胞凋亡率。4、H_2影响心肌细胞HR后ERS,降低CHOP表达与Con组相比,HR组ERS相关蛋白CHOP表达显著升高(P0.001),而H_2组CHOP表达显著高于HR组(P0.001),提示H_2影响心肌细胞HR后ERS,降低CHOP表达水平。(二)H_2调节ERS-CaMKⅡ-Ca~(2+)超载影响细胞凋亡机制研究1、CHOP介导H_2对心肌细胞CaMKⅡ氧化激活水平的影响与Con组相比,HR组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高(P0.001),而H_2组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著低于HR组(P0.001),提示H_2可降低细胞HR后CaMKⅡ氧化激活(即ox-CaMKⅡ)水平。当上调CHOP表达(即HR+Lv-CHOP组),与HR组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高(P=0.002),在此基础上再给予氢(即HR+Lv-CHOP+H_2组),与HR+Lv-CHOP组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值降低(P0.001),但与HR组之间无统计学差异(P=0.163);当下调CHOP表达(即HR+Lv-sh RNA组),与HR组相比,ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著降低(P0.001),在此基础上再给予氢(即HR+Lv-sh RNA+H_2组),与HR+Lv-sh RNA组相比,oxCaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著降低(P0.001),且与H_2组无统计学差异(P=0.940),提示CHOP介导H_2对CaMKⅡ氧化激活水平的影响。2、CaMKⅡ介导H_2对心肌细胞[Ca~(2+)]i水平的影响与Con组相比,HR组[Ca~(2+)]i水平显著升高(P0.001),而H_2组[Ca~(2+)]i水平显著低于HR组(P0.001),提示H_2可降低细胞HR后[Ca~(2+)]i水平。当KN-93抑制CaMKⅡ激活(即HR+KN-93组),与HR组相比,[Ca~(2+)]i水平显著降低(P0.001),在此基础上再给予氢(即HR+KN-93+H_2组),与HR+KN-93组相比,[Ca~(2+)]i水平显著降低(P=0.001),且与H_2组无统计学差异(P=0.143),提示CaMKⅡ介导H_2对[Ca~(2+)]i水平的影响。3、CaMKⅡ介导H_2对心肌细胞凋亡的影响与HR组相比,HR+KN-93组Bcl-2/Bax比值显著升高(P=0.004),而HR+KN-93+H_2组Bcl-2/Bax比值显著高于HR+KN-93组(P=0.030),且与H_2组无统计学差异(P=0.372),提示CaMKⅡ介导H_2对Bcl-2/Bax比值的影响。同样地,与HR组相比,HR+KN-93组细胞凋亡率显著降低(P0.001),而HR+KN-93+H_2组细胞凋亡率显著低于HR+KN-93组(P0.001),且与H_2组无统计学差异(P=0.272),提示CaMKⅡ介导H_2对细胞凋亡率的影响。(三)H_2调节ERS影响细胞凋亡的在体验证研究1、H_2减少心肌IR后羟自由基(·OH)和过氧亚硝基阴离子(ONOO-)反映·OH水平的8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHd G)在各组心肌中的阳性表达指数分别为:Sham 4.3±0.8%,IR 89.1±0.8%,H_2 54.9±5.0%,其中H_2组显著低于IR组(P0.001);反映ONOO-水平的3-硝基酪氨酸(3-NT)在各组中的阳性表达指数分别为:Sham 9.7±0.8%,IR 86.7±5.2%,H_2 63.4±7.4%,同样的,H_2组显著低于IR组(P0.001),提示H_2减少心肌IR中·OH和ONOO-的含量。2、H_2影响心肌IR后ERS,降低CHOP表达与Sham组相比,IR组CHOP表达水平显著升高(P0.001),而H_2组CHOP表达水平显著低于IR组(P=0.001),证实H_2可调控ERS,降低心肌IR后CHOP表达。3、H_2降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平与Sham组相比,IR组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著升高(P0.001),而H_2组ox-CaMKⅡ/CaMKⅡ比值显著低于IR组(P0.001),证实H_2可降低心肌IR后CaMKⅡ氧化激活水平。4、H_2减少心肌IR后细胞凋亡与Sham组相比,IR组Bcl-2/Bax比值显著降低(P0.001),而H_2组Bcl-2/Bax比值显著高于IR组(P=0.003),证实H_2在心肌IR后可通过升高Bcl-2/Bax比值而减少细胞凋亡。各组大鼠心肌细胞凋亡指数分别为:Sham 4.6±1.1%,IR 42.7±5.7%,H_228.1±6.9%。其中H_2组显著低于IR组(P=0.001),证实H_2可减少心肌IR后细胞凋亡数。5、H_2降低心肌IR后损伤各组大鼠血清中LDH含量分别为:Sham 2195.4±167.6 U/L,IR 4159.7±243.1 U/L,H_2 3699.4±182.7 U/L,其中H_2组显著低于HR组(P=0.003);各组大鼠血清中c Tn I含量分别为:Sham 35.4±3.5 ng/L,IR 150.5±18.4 ng/L,H_2 121.6±13.8 ng/L,其中H_2组显著低于HR组(P=0.005),证实H_2可减少心肌IR后损伤。6、H_2减少心肌IR后梗死面积与IR组相比,H_2组心肌梗死区面积/危险区面积(INF/AAR)显著降低(22.4±2.9vs 48.4±3.5%,P0.001),证实H_2可减少心肌IR后梗死面积。7、H_2改善心肌IR后心功能体现左心室心肌收缩能力的LVSP和+dp/dtmax在IR组均显著低于Sham组(92.4±6.3 vs 131.8±8.1 mm Hg,P0.001;3601.2±339.6 vs 8563.4±514.6 mm Hg/s,P0.001),而H_2组的LVSP和+dp/dtmax较IR组显著提高(120.0±9.7 vs 92.4±6.3mm Hg,P0.001;5801.0±816.8 vs 3601.2±339.6 mm Hg/s,P0.001),证实H_2可改善心肌IR后左心室心肌收缩能力,保护心功能。五、研究结论1、心肌IR能激活ERS,增加心肌细胞的凋亡;2、H_2可通过减轻心肌IR后ERS,下调CHOP表达,降低CaMKⅡ的氧化激活,减少细胞凋亡;3、H_2影响心肌细胞凋亡的具体机制与CaMKⅡ介导细胞内Ca~(2+)超载有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R54

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