冷诱导RNA结合蛋白在腹主动脉瘤中的表达及作用机制的研究

发布时间：2018-03-05 19:27

本文选题：腹主动脉瘤　切入点：冷诱导RNA结合蛋白　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和研究目的腹主动脉瘤(Abdominal Aortic Aneurysm,AAA)是一种常见的动脉退行性疾病,多见于老年人,据统计,腹主动脉瘤在老年人中的发病率为5～10%,随着年龄的增长,发病率逐渐增高,瘤体扩张速度亦逐渐加快。随着瘤体的增大,其逐渐出现压迫症状及远端栓塞症状,其破裂风险亦逐渐增高,一旦发生破裂,死亡率可高达90%。因此,目前普遍认为腹主动脉瘤具有高致死率,其已成为严重威胁老年人健康的主要疾病之一。腹主动脉瘤致死的主要原因是瘤体破裂出血。目前,动脉瘤切除+人工血管置换术和腔内覆膜支架修复术是防止腹主动脉瘤破裂的主要手段。目前一般认为当瘤体最大直径≥5.5cm时,腹主动脉瘤瘤体破裂的风险明显增高,此时应行手术或腔内治疗。而对于直径5.5 cm的小腹主动脉瘤,手术获益并不能完全战胜手术风险,对长期存活率亦无明显益处,应当进行密切的临床随访观察。既往研究显示,超过60%的小腹主动脉瘤患者随访过程中因瘤体增大或出现破裂征兆而需行手术治疗,但此时患者的全身状况往往已不能耐受开放手术治疗,而腔内覆膜支架治疗对动脉瘤的位置、形态等要求较高,腔内治疗有较大的局限性,部分患者因此而失去手术治疗的机会;还有些病人随访多年,瘤体变化不大,但仍需要定期密切随访。因此,探明腹主动脉瘤发生、发展的机制,寻求抑制腹主动脉瘤进展的药物具有非常重要的临床意义。目前,腹主动脉瘤发病的具体机制尚未完全阐明。近年来,随着对血管病理生理学、分子生物学等研究的深入,发现腹主动脉瘤瘤壁的病理改变包括平滑肌细胞减少、慢性炎症及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的过度降解与重塑等改变。而既往研究表明,瘤壁的慢性炎症参与腹主动脉瘤的形成、进展及破裂的整个过程,是腹主动脉瘤重要的病理学特征之一。一方面,瘤壁浸润的炎症细胞可分泌大量的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、单核巨噬细胞趋化因子-1(MCP-1)等多种炎症因子,引起瘤壁的损伤,同时其所分泌的炎症因子又可进一步趋化炎症细胞的浸润,进一步加重瘤壁的损伤。另一方面,瘤壁浸润的炎症细胞(如巨噬细胞、淋巴细胞等)可分泌大量的基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)等蛋白水解酶,而MMPs能够引起管壁弹力纤维等的降解,加剧瘤体的扩张。因此,瘤壁的慢性炎症是腹主动脉瘤形成、进展的重要因素之一。冷诱导RNA 结合蛋白(Cold-inducible RNAbinding protein,CIRP)是一种RNA结合蛋白,属于冷休克蛋白家族成员,广泛表达于多种组织,正常细胞呈低表达状态,而多种应激如低体温、缺氧、紫外线、H202等可上调CIRP的表达。既往研究表明,细胞在应激压力下,CIRP从细胞核转入细胞质,在细胞质中通过稳定某些细胞生存所必须物质mRNA的表达,进而帮助细胞度过应激压力。然而,近年来的许多研究表明,CIRP可被分泌到细胞外,参与多种疾病的炎症损伤,如失血性休克、脓毒血症、肝缺血再灌注损伤、脑缺血再灌注损伤等。CIRP作为内源性致炎因子可直接上调TNF-α、IL-6等炎症因子的表达,引发炎症的瀑布式反应,加重组织损伤。研究发现,CIRP在心、脑、肝、肾、肺、肠道及皮肤等组织的炎症反应过程中呈高表达状态,而且以CIRP为靶点的治疗措施可明显减轻组织损伤。但对于CIRP在腹主动脉瘤瘤壁炎症反应过程中的表达及作用,目前尚未见相关研究报道。我们将在本研究中对CIRP在腹主动脉瘤中的表达及其在瘤壁炎症反应过程中的作用进行探索。弹力蛋白酶腔内灌注诱导腹主动脉瘤模型是通过灌注管向腹主动脉腔内高压灌注猪I型弹力蛋白酶,使弹力蛋白酶溶液充分浸润到管壁各层,高压灌注后即刻出现腹主动脉灌注段的轻度扩张,随后引发管壁弹力纤维逐渐破坏,动脉壁出现大量巨噬细胞、T细胞、B细胞等炎症细胞的浸润,灌注段腹主动脉逐渐扩张成瘤。弹力蛋白酶腔内灌注模型是目前应用较多的腹主动脉瘤模型之一,可在一定程度上模拟临床腹主动脉瘤的某些病理特征。由于该模型的瘤壁炎症反应明显,符合本研究的研究目的,而且该模型稳定、大鼠手术操作简便。因此,我们将采用弹力蛋白酶腔内灌注大鼠腹主动脉瘤模型进行CIRP在腹主动脉瘤瘤壁炎症反应过程中作用的研究。本研究将通过检测腹主动脉瘤患者血清及瘤壁组织中CIRP的表达情况及其与瘤壁炎症的关系,并通过大鼠腹主动脉瘤模型研究CIRP在瘤壁炎症反应过程及腹主动脉瘤形成过程中的具体作用,并通过细胞学研究进一步探索其作用机制。在此基础上进一步阐明瘤壁炎症反应在腹主动脉瘤进展过程的作用,并为临床腹主动脉瘤的治疗提供理论依据及新的线索。研究内容第一部分:探索CIRP在腹主动脉瘤患者血清及瘤壁组织中的表达,并探索血清CIRP与瘤壁炎症的相关性。第二部分:探索CIRP在大鼠腹主动脉瘤模型中的表达,并进一步明确抗CIRP抗体对大鼠腹主动脉瘤的治疗作用。第三部分:探索C1RP在大鼠腹主动脉瘤瘤壁炎症及腹主动脉瘤发生、发展中的作用机制。研究方法第一部分:1.收集2014年1月～2015年6月期间于山东大学附属山东省立医院血管外科行腹主动脉瘤切除+人工血管置换术的腹主动脉瘤患者血清及瘤壁组织共计8例,以及8例健康体检(未发现腹主动脉瘤)的成人血清和8例多器官捐献者(器官捐献时未发现腹主动脉瘤)于山东省立医院行肾脏、肝脏移植时残留的部分正常腹主动脉组织。2.通过ELISA、Western blot技术检测血清中CIRP的表达,通过RT-PCR、Western blot检测瘤壁CIRP的表达,并通过免疫组化检测CIRP的表达位置,通过免疫荧光双染色技术检测CIRP的细胞来源。3.采用Spearson相关系数判定血清CIRP浓度与瘤壁炎症因子表达的相关性。第二部分:1.大鼠腹主动脉瘤模型的建立及分组:将雄性Wistar大鼠分为假手术组和腹主动脉瘤模型组。利用4-0慕丝线阻断腹主动脉近心端及远心端血流,30G的注射器针头穿刺腹主动脉前壁,置入PPE-10管,然后采用腔内灌注弹力蛋白酶溶液,术后给予B超检测、HE及EVG染色判定造模是否成功。2.RT-PCR、Western blot、免疫组化及免疫荧光检测大鼠腹主动脉瘤模型中CIRP的表达。3.抗CIRP抗体治疗实验分组:将腹主动脉瘤模型大鼠随机分为无免疫活性IgG治疗组和抗CIRP抗体治疗组,分别于术后24小时或术后2周开始给予相应治疗。4.HE、EVG染色、RT-PCR、Western blot及明胶酶谱等技术检测抗CIRP抗体治疗对瘤壁的保护作用。第三部分:1.RT-PCR、Western blot、明胶酶谱及免疫组化等技术检测抗CIRP抗体治疗后大鼠腹主动脉瘤瘤壁TLR4/NF-KB信号通路及炎症反应的变化。2.rmCIRP刺激实验分组:将生长状态良好的RAW 264.7巨噬细胞随机分为空白对照组,rmCIRP处理组和rmCIRP +抗CIRP抗体共同处理组。3.RT-PCR、Western blot 检测 rmCIRP 处理后 RAW 264.7 巨噬细胞 MMP-9 的表达变化。4.明胶酶谱技术检测rmCIRP处理后RAW 264.7巨噬细胞培养液MMP-9的活性变化。5.Transwell小室检测rmCIRP对RAW 264.7巨噬细胞迁移能力的影响。6.RT-PCR、Western blot 检测 rmCIRP 处理后 RAW 264.7 巨噬细胞 TLR4/NF-KB炎性通路的激活情况。研究结果第一部分:1.人体腹主动脉瘤瘤壁的基本检测情况:HE及EVG染色显示腹主动脉瘤瘤壁组织可见大量炎性细胞浸润、弹力纤维破坏等基本病理变化。RT-PCR检测发现瘤壁炎性因子TNF-a、HMGB1及TLR4 mRNA表达水平均明显升高。RT-PCR、Western blot及明胶酶谱技术检测发现瘤壁组织MMP-2/9的表达及活性均明显升高。2.CIRP在腹主动脉瘤患者中的表达情况:ELISA及Western blot检测发现腹主动脉瘤患者血清中CIRP的表达明显升高。RT-PCR及Western blot检测发现瘤壁组织CIRP的表达明显升高,同时免疫组化染色显示瘤壁CIRP不仅表达于细胞核、细胞浆,还部分弥散至细胞外。同时,免疫荧光双染色显示瘤壁CIRP表达于残存的平滑肌细胞及浸润的巨噬细胞。3.血清CIRP与瘤壁炎症的相关性:Spearson分析显示血清CIRP浓度与瘤壁炎性因子TNF-α的表达呈正相关(P=0.038 R=0.736)。第二部分:1.造模情况:大鼠腹主动脉瘤造模4周后行超声检测,结果显示瘤体最大直径均超过术前直径的50%,从腹主动脉直径变化方面表明大鼠腹主动脉瘤模型制作成功;瘤壁HE染色显示瘤壁组织的3层结构紊乱,其内膜、中膜及外膜组织被大量破坏,中膜的平滑肌细胞排列紊乱、数量减少、成纤维细胞明显增多,各层可见大量炎性细胞的浸润;同时,EVG染色显示瘤壁弹力纤维被大量破坏。2.大鼠腹主动脉瘤模型CIRP表达情况:RT-PCR、Western blot技术检测瘤壁组织CIRP的表达情况,结果显示,模型血清及瘤壁组织CIRP的表达水平均较假手术组明显升高。免疫组化染色显示模型组CIRP染色于细胞核、细胞浆及细胞间隙均可见表达。同时,免疫荧光双染色发现瘤壁组织CIRP表达于残存的平滑肌细胞及浸润的巨噬细胞。3.抗CIRP抗体对大鼠腹主动脉瘤的治疗情况:大鼠腹主动脉瘤模型抗CIRP抗体治疗后,B超检测显示,治疗组最大直径较模型对照组明显缩小。术后4周瘤壁组织EVG染色显示,治疗组瘤壁组织弹力纤维的破坏程度较模型对照组明显减轻,治疗组瘤壁组织可见部分弹力纤维残留。RT-PCR、Western blot检测发现,治疗组瘤壁组织MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达水平均较模型对照组明显降低;同时,明胶酶谱检测发现治疗组瘤壁组织MMP-2、MMP-9的活性亦得到明显抑制。第三部分:1.抗CIRP抗体治疗对大鼠腹主动脉瘤瘤壁TLR4/NF-κB信号通路及炎症反应的影响:大鼠腹主动脉瘤模型抗CIRP抗体治疗后,RT-PCR、Western blot检测发现,治疗组瘤壁组织TLR4/NF-κB信号通路与模型对照组相比明显被抑制。同时,RT-PCR、Western blot检测发现治疗组瘤壁组织MCP-1mRNA及蛋白表达水平均较模型对照组明显降低;而瘤壁CD68染色也显示治疗组瘤壁组织巨噬细胞的浸润程度较模型对照组明显减轻。2.rmCIRP刺激对RAW 264.7巨噬细胞迁移能力的影响:rmCIRP处理后Transwell小室检测发现rmCIRP蛋白可增加RAW 264.7细胞向小室底部迁移的数量,而该作用可被抗CIRP抗体所阻断。3.rmCIRP刺激对RAW 264.7巨噬细胞TLR4/NF-κB炎性通路的影响:rmCIRP处理后,RT-PCR、Western blot检测发现,rmCIRP蛋白可明显上调RAW 264.7细胞TLR4 mRNA及蛋白表达水平;同时,Western blot检测发现,rmCIRP蛋白可明显上调细胞核内NF-κB的表达,表明rmCIRP蛋白可促进NF-κB入核。4.rmCIRP刺激对RAW 264.7巨噬细胞MMP-9表达及活性的影响:rmCIRP处理后,RT-PCR检测结果显示低浓度rmCIRP不能明显上调RAW 264.7细胞MMP-9 mRNA的表达,但高浓度rmCIRP可明显上调MMP-9 mRNA的表达,即:rmCIRP蛋白上调MMP-9 mRNA的表达呈现浓度依懒性。同时,Western blot检测发现,rmCIRP蛋白可明显上调巨噬细胞MMP-9蛋白的表达水平,但该作用可被抗CIRP抗体所阻断。明胶酶谱法检测rmCIRP处理后RAW 264.7细胞上清液中MMP-9的活性,结果显示rmCIRP可明显上调巨噬细胞所分泌MMP-9的活性,但该作用同样可被抗CIRP抗体所阻断。结论1.CIRP在人体腹主动脉瘤的血清及瘤壁组织中存在异常高表达,而相关性分析显示,血清CIRP浓度与瘤壁炎性因子的表达呈正相关。2.C1RP在大鼠腹主动脉瘤模型的血清及瘤壁组织中亦存在异常高表达,而且抗C1RP抗体可明显抑制大鼠腹主动脉瘤瘤壁的炎症反应、瘤体的形成及进展,即:CIRP参与腹主动脉瘤的发生、发展过程。3.rmCIRP蛋白白可增加巨噬细胞的迁移能力及激活巨噬细胞TLR4/NF-KB信号通路,即:CIRP可通过趋化巨噬细胞等炎性细胞向瘤壁浸润及激活TLR4/NF-κB信号通路而参与瘤壁的损伤过程,进而促进腹主动脉瘤的病理进程。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R543.16

【参考文献】