体外循环期间心肌代谢变化及乙醛脱氢酶2活化的心肌保护实验研究

发布时间：2018-03-06 21:16

  本文选题：代谢　切入点：代谢组学　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：基于代谢组学的体外循环缺血再灌注期间心肌代谢特点研究研究目的体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)缺血再灌注期间临床干预以及机体的自身调节机制使心肌代谢发生复杂变化,然而缺乏系统性全面分析,本研究旨在利用代谢组学技术全面探索缺血再灌注期间心肌代谢变化特点。研究方法18只新西兰白兔随机分为正常对照组(C组,n=6)、缺血组(I组,n=6)、缺血再灌注组(IR组,n=6),同时需12只新西兰白兔作为I组及IR组供血兔。体外循环经右腋动脉、右房插管进行动脉灌注和静脉引流,左腋动脉置管入主动脉根部或主动脉根部荷包缝合插管进行停搏液的灌注。正常对照组正中开胸、体外循环插管后直接取左室心肌组织,缺血组主动脉阻断120min后取左室心肌组织,缺血再灌注组主动脉阻断120min,心肌恢复灌注120min后取左室心肌组织。心肌代谢特点采用气相色谱-质谱技术进行分析,对代谢组学数据进行多元统计分析(PCA,OPLS-DA法),作得分图、载荷图、热力图(heatmap)分析,结合OPLS-DA分析的VIP值与t检验的p0.05共同鉴定差异物质。研究结果I组与C组相比,代谢特点可被区分但差异不明显(Q2Y=0.357),确定13个代谢物在I组与C组相比具有统计学差异(VIP差异物1,P差异物0.05),两组间差异代谢物质主要与脂肪酸、氨基酸、核苷酸代谢相关。KEGG分析发现,代谢通路主要涉及鸟氨酸循环及嘧啶代谢的抑制。IR组代谢特点与I组明显不同(OPLS-DA分析模型Q2Y=0.714),得分图可完全分开,对图形区分产生贡献的物质组成载荷图,最终可确定82个代谢物在LR组与I组相比具有统计学差异(VIP差异物1,p差异物0.05),两组间差异代谢物质主要与能量、氨基酸、脂肪酸、核苷酸的代谢相关,涉及少量糖代谢产物,京都基因和基因组的百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析发现代谢通路主要涉及脂肪酸、氨基酸、糖酵解产物的生成增加,鸟氨酸循环的激活,此外与氧化应激相关的氨基酸、黄嘌呤氧化酶系统代谢产物增加,而抗氧化代谢产物减少。结 论本研究全面分析了缺血期间与再灌注期间心肌组织的代谢特点,确定了多条代谢通路的变化。研究发现体外循环心肌缺血期间,仅涉及到部分脂肪酸代谢、鸟氨酸循环、嘧啶代谢产物的差异变化。再灌注早期心肌恢复血供,脂肪酸、氨基酸、核苷酸代谢明显上调,但同时参与氧化应激的氨基酸、不饱和脂肪酸也明显增加,抗氧化剂谷氨酰胺生成减少,通过本研究推断再灌注损伤可能与心肌代谢中参与氧化应激代谢物质上调相关,因此本研究结果有助于进一步探索缺血再灌注心肌保护的复杂机制及心肌保护的改进策略。ALDH2活化在兔体外循环模型中的心肌保护效果及机制研究研究目的既往研究表明,脂质过氧化产物醛类的堆积与心肌功能的损伤密切相关,线粒体乙醛脱氢酶2(ALDH2)可有效清除毒性醛类物质,但体外循环(Cardiopulmonary bypass,CPB)期间受低温、醛类物质反向抑制、个体差异等因素影响,ALDH2活性受抑制,而ALDH2的活化对体外循环缺血再灌注心肌是否具有保护效应及具体机制尚无报道。因此本研究基于兔CPB心脏停跳模型,应用Alda-1特异性激活ALDH2,探讨其对体外循环期间心肌保护效果及可能的作用机制。研究方法实验对象为健康新西兰白兔,15-20周龄,体重2-3.5kg。第一阶段:实验兔随机分为体外循环组(C组,n=7)、体外循环停跳组(CA组,n=7)、体外循环停跳+Alda-1组(CAA组,n=7);第二阶段:实验兔随机分为体外循环停跳组(CA组,n=7)、体外循环停跳+渥曼青霉素组(CAW组,n=7),体外循环停跳+Alda-1组(CAA组,n=7),体外循环停跳+Alda-1组+渥曼青霉素组(CAAW组,n=7)。另随机分配35只新西兰白兔作为供血兔。所有新西兰白兔采用右腋动脉插管及右房插管建立CPB模型,降温至直肠温30℃,阻断升主动脉,灌注心脏停搏液,主动脉阻断2h后开放,复温至直肠温35℃以上生命体征平稳后停机,恢复心肌灌注2h取左室心肌组织。术中监测血流动力学指标、直肠温、血气变化。停机后取左室心肌标本,心肌组织匀浆测ALDH2含量活性,以及4-羟基壬烯醛(4-HNE)、丙二醛(MDA)、蛋白羰基、氧化型与还原型谷光甘肽(GSH/GSSG)含量、AKT磷酸化水平、自噬指标LC3II/I表达,透射电镜观察心肌细胞超微结构改变和线粒体损伤情况,检测CPB前、升主动脉阻断前、主动脉阻断120min、升主动脉开放后5min、停机后血气及CK-MB变化趋式。研究结果缺血再灌注期间4-HNE、MDA堆积,与C组比较存在统计学差异(4-HNE:PCA vsC0.001;MDA:PCAvs.C=0.001)。ALDH2含量在组间比较无明显差异,应用Alda-1后,CAA组与CA组相比ALDH2活性明显增加(PCAAvs.CA0.001),心肌4-HNE、MDA 的堆积明显减轻(4-HNE:PCAAvs.CA=0.013;MDA:PCaAvs.CA0.001)。应用 Alda-1后心肌蛋白羰基水平、血清CK-MB明显减低,GSH/GSSH增加,CAA组与CA组相比均存在统计学差异(p0.05),停机后CAA组dp/dtmax较CA组明显升高(p=0.040),但LVEDP、LVESP、dp/dtmin在三组间均无统计学差异,此外研究发现自噬标记物LC3M在CAA组较CA组明显降低,但TUNEL凋亡阳性细胞在三组间无统计学差异。第二阶段结果表明,PI3K-AKT通路抑制剂渥曼青霉素的应用可明显抑制再灌注期间心肌AKT磷酸化与微管相关蛋白(LC3)表达,CAW组与CA组比较存在统计学差异(p0.05)。CAA组与CA组、CAAW组比较发现,4-HNE、AKT磷酸化水平均增加,自噬标记物LC3Ⅱ/Ⅰ明显下降,组间比较存在明显统计学差异(p0.05)。研究结论1.体外循环期间ALDH2活化可加强毒性醛类清除,增强心肌的抗氧化损伤能力,减轻心肌的氧化应激水平,心肌收缩功能得以改善,此外本研究还发现再灌注期间自噬程度明显减轻,但TUNEL检测凋亡阳性细胞无明显差异。2.再灌注期间,ALDH2可能通过AKT活化负向调节自噬水平,进而改善再灌注期间心肌损伤,但具体调节分子机制及下游通路仍待进一步探索;3.本研究在体外循环模型中证实,ALDH2活化具有明确心肌保护效果,但可能涉及到多个机制共同作用的结果,因此将来仍需要进一步探索氧化应激、线粒体自噬相互作用的分子机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R654.1

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本文编号：1576537