CNOT7基因敲除逆转肝细胞癌对IFN-γ耐受的研究

发布时间：2018-03-09 01:04

  本文选题：CNOT7　切入点：肝癌　出处：《山西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:在我国肝细胞癌是发病率和致死率均居第四位的恶性肿瘤。肝脏由于各种因素所致的炎症,引起肝实质细胞的持续破坏和再生,导致肝炎和肝硬化出现,并最终导致肝癌的发生。慢性炎症可导致肿瘤的发生,目前已经得到医学界广泛认可。引起慢性肝脏炎症的因素包括:各种肝炎病毒如HBV,HCV的感染,酒精滥用,药物滥用等。其中HBV感染是目前导致我国肝癌发生的主要因素之一。Ⅱ型干扰素(IFN-γ)作为一种重要的细胞因子参与了机体固有免疫应答和适应性免疫应答,参与了机体抗病毒和抗肿瘤的过程。干扰素包括很多类型,目前已经广泛被用于病毒所导致肝炎和肝细胞癌的治疗。但现有证据表明,主要是IFN-γ参与了机体自发的抗肿瘤反应,而不是其他类型的干扰素。然而单纯增加肝细胞癌患者血中IFN-γ的水平并不能增强抗肿瘤效果。有资料显示肝癌细胞对IFN-γ具有耐受性。肿瘤对IFN-γ的耐受主要是由于肿瘤细胞内IFN-γ的信号传递因子STAT1表达下降所引起,重新导入STAT1基因后可以逆转这种耐受。CNOT7是CCR4-NOT蛋白复合体的一个重要功能亚基,在某些肿瘤中高表达。有文章证明CNOT7具有调控干扰素的作用,通过控制STAT1本身的转录和降解其下游的信号因子从而抑制干扰素的功能。本研究的目的是探讨CNOT7基因在HBV所致肝癌的中表达的变化;研究CNOT7基因表达变化与肝癌细胞对IFN-γ耐受的关系;探索CNOT7基因参与肝癌细胞免疫耐受的机制。方法:我们用ELISA法检测了乙型肝炎肝癌患者和乙型肝炎肝硬化患者外周血中IFN-γ的水平;用免疫组织化检测了乙型肝炎肝癌组织中CNOT7,STAT1和STAT3的表达。我们用MTT,流式细胞术,检测四株肝癌细胞系对IFN-γ的耐药性;用qPCR和western blot检测了四株肝癌细胞系CNOT7,STAT1和STAT3的表达,并筛选合适的实验用肝癌细胞株。我们采用CNOT7基因敲除和过表达的方法探索CNOT7和STAT1的关系,并建立稳转细胞株(HepG2sh CNOT7)和(HepG2CNOT7)。我们用MTT,流式细胞术,检测HepG2~(shCNOT7)对IFN-γ的耐药性。最后,我们用qPCR和western blot检测IFN-γ作用于HepG2~(shCNOT7)后STAT1,STAT3,cyclinE1和caspase3的变化。结果:实验结果提示肝癌患者血液中ifn-γ的水平并未出现明显下降,提示肝癌的发生与ifn-γ水平下降关系不密切。而肝癌组织中stat1的表达明显下调。提示肝癌的发生可能与肿瘤细胞对ifn-γ的耐受有关。肝癌组织中cnot7表达的上调与stat1表达下调明显相关,提示高表达cnot7可能是抑制stat1表达的原因之一。stat3是stat家族的另一个重要的细胞因子,在生物反应过程中扮演着与stat1的相反的角色。但实验中stat3在肝癌的表达与周围正常组织相比未见明显升高。该实验结果出乎我们的意料,也与既往的研究结果不相符,分析实验结果无误后,我们推测可能的原因是乙肝肝癌患者体内ifn-γ水平较高,高水平的ifn-γ刺激肝癌细胞stat1表达,从而抑制了stat3的表达。我们选用四种肝癌细胞系检测对ifn-γ的耐药性,并筛选合适的实验用肝癌细胞株。实验结果提示:这四种细胞的耐药性与肿瘤cnot7和stat1的表达水平有关。cnot7的表达越高,肝癌细胞的耐药性越明显,而stat1的表达则正好相反。实验结果还提示hepg2是我们下一步实验用的理想细胞株。我们采用cnot7基因敲除和过表达的方法探索cnot7和stat1的关系。我们对hepg2细胞进行cnot7基因敲除(hepg2shcnot7)和过表达(hepg2cnot7),并建立稳转细胞株。实验结果显示:cnot7基因敲除,可促进stat1的蛋白表达上调;cnot7基因过表达,则stat1的蛋白表达受到明显的抑制。但在整个实验中stat1mrna的水平并未出现明显的变化。为进一步探索cnot7和stat1内在作用机制,我们采用免疫共沉淀分析二者间的关系。共沉淀结果提示:cnot7通过与静息状态的stat1蛋白直接结合,抑制stat1的磷酸化入核,抑制stat1的自身循环。从而负性调控ifn-γ对肝癌细胞的作用。我们用ifn-γ对cnot7基因敲除的hepg2(hepg2shcnot7)稳转细胞株进行干预。检测其增殖的变化。实验结果显示:cnot7基因敲除本身对hepg2的影响并不明显,但逆转了肝细胞癌对ifn-γ耐受。hepg2shcnot7在受到ifn-γ的干预后,明显出现增殖抑制、周期阻滞、凋亡率上升。最后,我们对cnot7基因敲除逆转肝细胞癌对ifn-γ耐受的机制进行了探索。实验结果显示:ifn-γ干预hepg2shcnot7后stat1的表达显著上调,肿瘤周期调控蛋白cycline1的表达出现明显下降,发生周期抑制;caspase3的表达则明显上升,并出现其功能激活状态cleavedcaspase3,肿瘤细胞的凋亡明显上调。cnot7基因敲除,明显逆转了肝癌细胞对ifn-γ的耐受。stat3作为与stat1的功能截然相反的另外一种信号蛋白。我们的实验结果也证实:肝癌细胞CNOT7基因敲除后,IFN-γ可相对抑制HepG2sh CNOT7细胞中STAT3的表达,抑制了STAT3的促增殖功能。基于我们的实验结果,我们证明了STAT1和STAT3之间存在着某种的竞争性抑制关系。IFN-γ对肿瘤细胞的作用主要取决于STAT1/STAT3的比值。当STAT1正常表达时,IFN-γ的功能以激活STAT1为主,表现出抑癌作用;当STAT1缺乏时,IFN-γ的功能可能以激活STAT3为主,表现出促肿瘤生长的作用。结论:我们的实验证明乙肝肝癌患者肿瘤的发生归结于IFN-γ的耐受,而不是IFN-γ的缺乏。IFN-γ的耐受主要与STAT1的下降和CNOT7的上调有关。CNOT7基因敲除可明显逆转肝癌细胞对IFN-γ的耐受。CNOT7作为一种IFN-γ的负性调控因子,由于乙肝肝癌患者本身血液中IFN-γ水平并未出现明显下降,抑制肝癌患者体内CNOT7的表达,应该能够起到一定抗肿瘤的作用。而本身CNOT7基因敲除对细胞的影响极小,可能预示这这种方法在临床应用中副作用较小,临床实用性更强。考虑到CNOT7基因敲除强大的免疫佐剂效果,这种方法可能为目前已经走入困境的免疫治疗提供重要的帮助。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 徐卫东,张春平,王桂荣;肝细胞癌的变化模式[J];国外医学(内科学分册);2000年10期

2 ;早期发现肝细胞癌可增加治疗机会[J];河南医学研究;2000年02期

3 Schafer DF,潘朝法,李苏云;肝细胞癌[J];第四军医大学吉林军医学院学报;2000年01期

4 中沼安二,林淑兰,姚桢;有关小肝细胞癌病理学的最新认识[J];日本医学介绍;2000年05期

5 静雨;;美国肝细胞癌发病率增高[J];国外医学情报;2000年01期

6 张玉勋;;肝细胞癌的非手术治疗[J];国外医学情报;2000年05期

7 徐宏勇,李开宗,付由池,窦科峰,李景梦,何扬举;bcl-x,bax基因表达与肝细胞癌临床病理特征的关系[J];第四军医大学学报;2001年14期

8 蔡端;多中心源肝细胞癌的特征:与肝内转移的比较[J];国外医学.外科学分册;2002年02期

9 张春平;与白介素-18水平升高有关的肝细胞癌自发性消退[J];国外医学(内科学分册);2003年03期

10 薛海鸥,岳莉;儿童肝细胞癌1例报告[J];锦州医学院学报;2003年04期

相关会议论文 前10条

1 卞读军;;肝细胞癌经导管动脉化疗栓塞前后磁共振波谱研究[A];2009中华医学会影像技术分会第十七次全国学术大会论文集[C];2009年

2 贾建伟;赵洁;;肝细胞癌领域研究现状与进展[A];中医药防治感染病之研究（九）——第九次全国中医药防治感染病学术交流大会论文集[C];2009年

3 陈孝平;;肝细胞癌外科治疗进展[A];湖北省第21届肿瘤学术大会论文汇编[C];2011年

4 张杰;刘军建;韩云;张宁;芮静安;金城;周柔丽;;用荧光差异显示法筛选肝细胞癌相关新基因[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

5 冯仕庭;李子平;谭国胜;孙灿辉;彭振鹏;;中晚期肝细胞癌的多层螺旋CT血管造影表现及临床应用[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编（下册）[C];2006年

6 张法标;方哲平;王义;董辉;丛文铭;;上皮钙粘素和β-连接素在儿童肝细胞癌中的表达及其临床意义[A];2007年浙江省外科学学术会议论文汇编[C];2007年

7 陈钟杰;;螺旋CT诊断原发型肝细胞癌28例[A];2008年浙江省放射学年会论文汇编[C];2008年

8 贾克东;;肝细胞癌的诊断进展及治疗现状[A];全国中西医结合肝病新进展讲习班、江西省第二次中西医结合肝病学术会议资料汇编[C];2010年

9 李秋萍;龙顺钦;杨小兵;邓宏;蔡姣芝;潘宗奇;河文峰;周宇姝;欧阳育树;廖桂雅;吴万垠;;癌服灵治疗晚期肝细胞癌的临床研究[A];2012·中国医师协会中西医结合医师大会第三次会议论文集[C];2012年

10 朱明华;祝峙;刘晓红;林静;曲建慧;陈颖;曹晓哲;王力;倪灿荣;;乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌发生关系的分子病理学研究[A];中华医学会病理学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会主任委员 秦叔逵;治疗肝细胞癌 别只盯着靶向药[N];健康报;2013年

2 记者 王丹 管九苹;肝细胞癌标志物研究获新进展[N];健康报;2013年

3 吴一福;四军医大唐都医院发现硒蛋白P与肝细胞癌发生有关[N];中国医药报;2007年

4 黎彬;肝癌研究重要进展——预测肝癌转移成为可能[N];中国医药报;2004年

5 钱文彩;α2δ1阳性细胞为新的肝细胞癌干细胞[N];中国医药报;2013年

6 新美;基础研究进展推动肝脏病学进步[N];中国医药报;2008年

7 周金莲;MIB-1和bcl-2表达预测肝癌发生[N];中国医药报;2004年

8 张金山;要灵活运用影像学提供的方法和手段[N];中国高新技术产业导报;2001年

9 李杰;不能手术切除肝细胞癌的治疗[N];科技日报;2006年

10 ;修复肝细胞 改善肝功能[N];人民日报海外版;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 白兰;乙肝病毒捕获细胞因子和信号级联以逃避宿主免疫并维持持续感染[D];武汉大学;2014年

2 何洪卫;肝细胞癌内γδT细胞浸润减少及功能缺陷的机制研究[D];复旦大学;2014年

3 蔡晓燕;淋巴细胞在肝细胞癌和癌旁组织中的差异性表达研究[D];复旦大学;2014年

4 向导;细胞周期因子FoxM1促进肝脏再殖的研究[D];第二军医大学;2015年

5 康富标;共刺激分子B7-H3在肝细胞癌的表达及相关机制研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

6 杨纯;Gankyrin正反馈调控Nrf2在肝细胞癌中发挥抗氧化作用[D];第二军医大学;2015年

7 高霞;PNPLA3基因单核苷酸多态性及基因表达与乙肝病毒感染易感性及乙肝相关肝细胞癌的关联性研究[D];河北医科大学;2016年

8 彭晨星;microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究[D];河北医科大学;2016年

9 田伟;γδT细胞免疫治疗肝细胞癌的实验研究[D];山西医科大学;2016年

10 叶甲舟;RBM8A与肝细胞癌的相关性及对肝细胞癌增殖及凋亡生物学特性的影响[D];广西医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 王飞;CDH17调控肝细胞癌的生物学机制的研究[D];福建医科大学;2015年

2 陈中博;咖啡摄入与肝细胞癌发病风险的Meta分析[D];河北医科大学;2015年

3 张华鹏;核受体辅激活蛋白5在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义[D];郑州大学;2015年

4 郭慧敏;血清sCD25测定在肝细胞癌诊断中的意义[D];郑州大学;2015年

5 凌青霞;双氧化酶1（Duox1）在肝细胞癌中的表达调控及作用研究[D];复旦大学;2014年

6 李会芬;血清Talin-1在肝细胞癌诊断中的作用[D];郑州大学;2015年

7 蒙锦莹;血管生长相关因子的血清浓度与肝细胞癌预后的相关性研究[D];兰州大学;2015年

8 战勇;肝细胞癌术前造影参数与生物学表现相关性及术后复发相关因素讨论[D];中国人民解放军医学院;2015年

9 姚乐;microRNA-32在肝细胞癌中的表达及其临床预后意义[D];河北医科大学;2015年

10 吴华;MACC1在肝细胞癌中的表达与临床意义[D];安徽医科大学;2015年

，

本文编号：1586307