免疫抑制疗法对allo-HSCT小鼠体内潜伏MCMV活化作用的研究

发布时间：2018-03-11 03:16

本文选题：鼠巨细胞病毒　切入点：异基因造血干细胞移植　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是β疱疹病毒家族的一员,在人群中的感染率高达50%,因而在近些年的病毒学研究中受到广泛关注。对免疫功能正常的个体而言,CMV的原发感染通常表现为自限性,感染后宿主无明显的疾病症状。然而,CMV感染后可以在这些宿主体内建立伴随终生的潜伏状态。一旦这些宿主由于各种原因(例如接受器官移植、感染艾滋病的病毒等)导致免疫功能低下,潜伏状态的CMV可以重新在体内活化感染。目前针对CMV感染的常规药物(例如更昔洛韦、膦甲酸钠等)已在临床应用中证明了其可有效降低CMV的复制效率,但由于这些药物使用后可能带来的诸多副作用(包括血小板减少症、嗜中性白血球减少症以及细菌感染的风险),其在实际临床应用中受到严格的限制。另外,关于给予患者长期药物治疗后出现了具有耐药性的CMV新病毒株的报道也日益增多。因此,在临床异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)患者中若检测到CMV的潜伏再活化,特别是当其引发CMV病毒间质性肺炎时,如何优化治疗方案以降低移植受者的发病率和死亡率对医务工作者提出了严峻的挑战。目前,已有相关研究设想并探索了大量与CMV潜伏和活化相关的可能因素。然而,已报道的影响病毒活化的证据之间存在矛盾,需要对其进一步探索和验证,例如免疫抑制治疗对allo-HSCT后患者体内CMV活化有何影响。一方面,免疫抑制治疗可能降低抗CMV特异性的细胞免疫应答功能,进而增加CMV活化风险。当前的临床移植方案中,通过各种措施促进抗病毒免疫功能的尽早恢复仍是防治CMV最理想的方案。另一方面,大量证据证明,移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)的发生和进展(其同时也是免疫抑制疗法的治疗指征)与CMV活化紧密相关,但目前尚不明确其中的机制。更重要的是,GVHD发生后会显著升高的促炎症因子之一——肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)作为一种启动CMV立即早期(immediate-early,IE)基因表达的重要因素已得到证明。因此,免疫抑制剂在allo-HSCT中对潜伏CMV的活化作用还需进一步探索和研究。由于人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)所侵袭的宿主受到严格的种属特异性所限制,大部分学者将鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,mcmv)作为hcmv体内研究的重要工具。mcmv感染的小鼠已被证明是一种可替代hcmv临床感染的可靠模型,并在大量cmv潜伏活化研究中使用,其在病毒的原发感染、潜伏建立、病毒再活化方面和hcmv临床感染的表现和机制十分类似。在本研究中,本研究构建了mcmv感染balb/c小鼠后潜伏和活化的动物模型。在此基础上,本研究分别探索了在并发轻微gvhd和并发严重gvhd的两种allo-hsct小鼠模型中,免疫抑制剂对mcmv活化的作用。在所构建的并发严重gvhd并且免疫功能恢复不佳的allo-hsct模型中,本研究发现免疫抑制疗法可以减轻mcmv的活化水平。随后,本研究进一步证明了这种免疫抑制剂带来的抗病毒作用与降低的tnf-α水平有关。本研究的具体内容和结果概括如下:1.mcmv病毒潜伏感染小鼠模型的建立和鉴定本研究探索了小鼠感染mcmv后体内病毒的动态变化。在扩增实验所需的mcmv病毒后,研究人员对其滴度进行了测定。随后给予balb/c小鼠腹腔注射1×105pfumcmv,并在感染后14d、60d、180d分别处死3-4只,并留取其血液和肺组织。对全血进行的实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr,qpcr)结果显示,感染后14d小鼠血液中存在极高载量的病毒,然而感染后60d及180d血液中已检测不到病毒存在;通过半数细胞感染量(mediumtissuecultureinfectivedose,tcid50)方法检测肺组织的病毒滴度,以及反转录pcr法(reversetranscriptionpcr,rt-pcr)检测ie基因表达,感染14d时可分别检测到感染性病毒和ie基因表达,而感染后60d及180d时均未检测到。间接elisa实验提示,抗mcmv的igg抗体水平在移植后14d显著升高,并在移植后60d及180d处于稳定水平。研究人员在后续实验中将感染3-4wk小鼠1×105pfumcmv,并连续培育180d作为mcmv在小鼠体内建立潜伏的标准。2.免疫抑制治疗在并发轻微gvhd的allo-hsct小鼠模型中可促进mcmv活化为避免gvhd的发生损伤移植后免疫功能的恢复,本研究首先探讨了在并发轻微gvhd的allo-hsct小鼠中免疫抑制剂对病毒活化的影响。潜伏mcmv的balb/c小鼠接受8.5gy辐照及1×107个c57bl/6小鼠骨髓细胞。后续免疫抑制治疗中选用了2种临床治疗中常用的免疫抑制药物:环孢素(cyclosporina,csa,商品名赛斯平)和雷帕霉素(rapamycin,rapa,商品名西罗莫司)。在移植后研究人员对3组小鼠(placebo组,csa组,rapa组)进行了为期两个月的观察。由于骨髓细胞中仅含有少数的t淋巴细胞,所有小鼠在移植后均未出现明显的gvhd反应,并且死亡率较低。移植56d后所有小鼠处死,随后对病毒活化情况进行了观察,检测指标为小鼠14d、28d、42d、56d的血液mcmv载量及肺组织的mcmv滴度。结果显示接受免疫抑制剂的小鼠其allo-hsct后病毒活化明显高于对照组。本部分研究结果提示在并发轻微gvhd的allo-hsct小鼠模型中,免疫抑制治疗可促进潜伏小鼠体内的mcmv病毒活化。3.免疫抑制剂在并发轻微gvhd的allo-hsct小鼠模型中强烈抑制宿主的抗mcmv免疫应答本研究随后对免疫抑制治疗是否影响了免疫功能恢复进而增强mcmv活化进行了检测。小鼠移植后血液嵌合pcr结果显示,各组小鼠均可观测到供鼠来源的血液细胞,表明移植物可在受鼠体内长期存在。移植后14、28、42、56d的血常规结果提示,在移植后一个月时,经免疫抑制剂处理小鼠的血象恢复有暂时性的延迟,然而在移植后第二个月,其血象水平已和安慰对照组小鼠无统计学差异。为进一步观测移植后小鼠免疫功能的恢复情况,本研究通过流式细胞术对血液和脾中mcmv-cd8+t淋巴细胞进行检测。结果显示给予免疫抑制剂处理后的小鼠不能产生足够数量的mcmv-cd8+t淋巴细胞,提示免疫抑制剂的使用抑制了宿主的抗病毒免疫应答。这解释了免疫抑制疗法如何在并发轻微gvhd的小鼠allo-hsct模型中增加mcmv活化风险。4.免疫抑制疗法在并发严重gvhd的allo-hsct小鼠模型中抑制gvhd导致的损伤为建立并发严重gvhd的allo-hsct小鼠模型,本研究将移植的参数改良为7gy照射,并从潜伏mcmv的c57bl/6小鼠中移植1×107个骨髓细胞和1×107个脾细胞给予潜伏感染的balb/c受鼠。所有接受移植的小鼠共划分为三组,分别接受csa、rapa以及安慰剂,剂量同上述模型一致,并对小鼠的生存率和gvhd评分进行记录。移植后对小鼠的观察结果提示,无论是小鼠的一般状态、生存率还是gvhd评分,免疫抑制剂(csa或rapa)均对小鼠的gvhd发生有明显的抑制作用。在移植后28d研究人员处死所有小鼠,并留取样本进一步观察gvhd的情况。肠道病理切片结果表明,对照组小鼠的肠道结构损伤严重,可观察到肠绒毛削弱,黏膜结构缺失等,与免疫抑制组样品相比,gvhd损伤程度更高,各组切片的病理评分汇总后差异有统计学意义。针对相关炎症因子的检测结果显示,接受免疫抑制治疗的小鼠中tnf-α和白细胞介素2(interleukin-2,il-2)水平均明显低于对照组,但γ干扰素(interferon-γ,ifn-γ)在各组间无统计学差异。以上数据表明,在本实验构建体系中,免疫抑制剂的处理能够降低移植后小鼠的gvhd损伤。5.并发严重gvhd的allo-hsct模型中小鼠的抗病毒免疫功能恢复匮乏本研究进一步检测了各组小鼠allo-hsct后的造血和免疫功能恢复情况。血液嵌合pcr结果显示,所有小鼠在allo-hsct后28d时均检测到了供鼠来源的血液细胞存在。血象结果提示各组小鼠的白细胞数回升缓慢,同时血液中几乎检测不到淋巴细胞存在。而针对特异性t淋巴细胞的流式检测同样说明各组均未检测到cmv-cd8+t淋巴细胞。这说明在此模型中,gvhd严重地损伤了移植后小鼠总淋巴细胞的恢复,进而也显著削弱抗病毒免疫应答。gvhd(而非免疫抑制剂),导致了各组小鼠的抗mcmv特异性的免疫功能丧失,因而无论接受免疫抑制剂与否,各组小鼠的抗病毒免疫功能无明显差异。6.免疫抑制治疗在并发严重gvhd的allo-hsct小鼠模型中对mcmv活化有抑制作用在上述构建的并发严重gvhd的allo-hsct小鼠模型中,本研究进一步探索了免疫抑制剂与mcmv活化的关系,并发现免疫抑制组中小鼠的肺组织病毒滴度和血液中病毒拷贝数均明显低于对照组小鼠,这表明免疫抑制剂在此模型中对mcmv的活化有抑制作用。7.免疫抑制治疗可通过抑制tnf-α分泌进而减轻mcmv活化本研究随后对免疫抑制剂如何降低mcmv活化的机制进行了探索。由于上述结果显示2种促炎症因子可能与mcmv的活化有关,本研究分析了小鼠血浆中炎症因子水平与血液中病毒载量的相关性。结果显示活化的mcmv载量与tnf-α水平呈现明显的正相关,而mcmv活化与il-2未发现明显的关联。以上结果表明,tnf-α可能是导致mcmv活化的重要因素。为进一步验证tnf-α在mcmv活化中的作用,本研究通过tnf-α分泌抑制剂——来那度胺(lenalidomide,len)重新设计了实验。本研究将所有小鼠划分为4组,分别给予安慰剂(placebogroup),来那度胺联合安慰剂(len+placebogroup),来那度胺联合环孢素(len+csagroup),来那度胺联合雷帕霉素(len+rapagroup),其他allo-hsct的参数和步骤与并发严重gvhd的allo-hsct小鼠模型一致。移植后28d,所有小鼠处死。随后本研究对肺组织中的mcmv进行了免疫组化检测,并对组化结果进行了定量和评分,靶标为病毒表面抗原糖蛋白b(murinecytomegalovirusglycoproteinb,mcmv-gb)。结果显示接受来那度胺的三组(len+placebogroup,len+csagroup和len+rapagroup)小鼠的mcmv活化明显低于仅接受安慰剂的小鼠(placebogroup),并且在接受来那度胺处理的三组小鼠之间,其mcmv活化无统计学差异。针对血液中mcmv载量的qpcr结果与上述免疫组化结果一致。另外,elisa检测验证了来那度胺的使用显著降低了血浆中TNF-α的水平。这些结果表明,TNF-α是MCMV活化的关键调控因子,TNF-α分泌下降后MCMV的活化随即减少。免疫抑制治疗可通过抑制TNF-α分泌进而减轻MCMV活化。总之,本研究表明,在allo-HSCT后免疫抑制剂的使用对MCMV活化有双重的影响,特别是在并发严重GVHD的allo-HSCT小鼠模型中,免疫抑制剂通过减轻GVHD发展程度,降低TNF-α水平,进而对MCMV活化起抑制作用。因此,本研究加深了人们对于免疫抑制剂与CMV活化之间关系的了解和认识,并为临床中移植方案的选择、抗病毒策略的制订提供了新的依据。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R457.7;R511

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