MINA在胶质母细胞瘤细胞增殖和肿瘤生长中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-16 20:16

本文选题：MINA　切入点：胶质母细胞瘤　出处：《西南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胶质母细胞瘤(glioblasoma,GBM)为IV级、恶性程度最高的胶质瘤,具有高增殖、高浸润、高复发,手术难以切除、放疗化疗抵抗等特点,目前疗效不甚理想,寻找新的治疗靶点尤为迫切。MINA(MYC induced nuclear antigen)属于组蛋白去甲基化酶JMJD家族,具有H3K9me3去甲基化功能,在多种肿瘤中高表达且预示着较差的病人预后,然而目前对MINA在肿瘤中的具体作用及作用机制尚不清楚。本论文主要研究了MINA在胶质母细胞瘤细胞中所扮演的角色,从体外细胞水平及体内实验动物水平深入探索了MINA对胶质母细胞瘤细胞增殖与肿瘤生长的影响及潜在的分子机制,并结合临床数据库及临床组织样本分析,对MINA作为胶质母细胞瘤治疗靶标的可行性进行了评估,揭示了MINA在肿瘤发生、发展过程中可能扮演的原癌基因的角色。主要研究结果如下:1、MINA在胶质母细胞瘤细胞中广泛表达,且MINA的表达与胶质母细胞瘤患者的预后成负相关为了探讨MINA在胶质母细胞瘤中扮演的角色,我们首先在若干胶质母细胞瘤细胞系包括LN-229、U-251 MG、U-87 MG、U-118 MG和A-172中检测分析了MINA的表达情况。我们分别利用RT-PCR和Western blot检测了MINA在上述细胞系中的m RNA和蛋白表达水平。结果发现MINA在胶质母细胞瘤细胞系中普遍表达,且相对恶性的细胞中MINA的表达量高于相对良性细胞的MINA表达量。通过病理分析多个胶质母细胞瘤临床组织样本和其相应癌旁组织样本中MINA的表达情况,我们发现,胶质母细胞瘤临床组织样本中MINA的表达量显著高于其相应癌旁组织样本中MINA的表达量,且在癌旁组织样本(接近于正常组织)中,MINA几乎不表达。进一步地,我们利用R2检索多个胶质母细胞瘤及胶质瘤预后数据库,分析MINA的表达与患者预后及肿瘤分级的关系,结果发现高表达MINA的胶质母细胞瘤和胶质瘤病人有着更差的预后情况,MINA表达量越高患者生存时间越短,越容易复发;且MINA的表达量与胶质瘤的分级成正相关,等级越高恶性程度越高的胶质瘤中MINA的表达量也越高。这些结果暗示MINA在肿瘤发生、发展过程中极有可能扮演着一个原癌基因的角色,为我们后续进一步研究MINA在胶质母细胞瘤中的作用奠定了基础并提供了现实意义。2、MINA调控胶质母细胞瘤细胞生长、增殖和克隆形成能力依据MINA可能在胶质母细胞瘤中扮演原癌基因角色的结论,我们对MINA在胶质母细胞瘤中扮演的角色进行了探讨与验证。我们利用慢病毒介导的短发夹RNA(short hairpin RNA,sh RNA)干扰技术在两个胶质母细胞瘤细胞系LN-229和U-87 MG中下调了MINA的表达,并随后在下调MINA表达后的胶质母细胞瘤细胞中进行了生物学功能性分析。首先我们检测了下调MINA对胶质母细胞瘤细胞生长和活力的影响。通过镜检及MTT细胞生长活力检测实验,我们发现,下调MINA的表达之后,胶质母细胞瘤细胞的生长活力明显受到抑制且MINA对胶质母细胞瘤细胞生长的影响存在着一定的剂量关系,MINA表达量越高,胶质母细胞瘤细胞的生长越快。进一步地,我们进行了5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brd U)荧光染色实验,检测了干扰MINA之后胶质母细胞瘤细胞的增殖能力。结果发现,对照组比干扰组具有明显更高的Brd U阳性率,说明干扰MINA之后,胶质母细胞瘤细胞的增殖能力受到了显著抑制。此外,我们还对干扰MINA之后的胶质母细胞瘤细胞进行了Soft-Agar软琼脂实验,检测其克隆形成能力。结果显示,无论是克隆形成的数量还是大小,干扰组的数值都显著小于对照组。说明干扰MINA之后,胶质母细胞瘤细胞的克隆形成能力受到了显著抑制。这些结果说明,MINA对胶质母细胞瘤细胞的生长、增殖和克隆形成至关重要。为了对MINA在胶质母细胞瘤细胞生长、增殖和克隆形成过程中的重要作用提供更多的证据支撑,我们在干扰MINA后的胶质母细胞瘤细胞中通过过表达手段回复了MINA的表达,以期检测其生长、增殖和克隆形成能力是否得以回复。我们根据sh MINA#2短发夹RNA的靶向作用位点,设计了可以成功过表达而不被sh MINA#2靶向性降解且蛋白序列与野生型MINA无差别的MINA-R,并验证了在干扰MINA之后,回复MINA-R可显著回复MINA的表达。利用MTT法检测细胞生长曲线,Brd U法检测细胞增殖,Soft-Agar软琼脂实验检测细胞克隆形成能力等,我们发现,在干扰MINA之后再次回复MINA成功地挽救了细胞的生长、增殖和克隆形成。这些结果更加强力地说明MINA确实起到了促进胶质母细胞瘤细胞生长、增殖和克隆形成的作用。3、MINA调控胶质母细胞瘤的细胞周期进程为了进一步探索MINA如何调节胶质母细胞瘤细胞的增殖,我们选取了干扰MINA后3天和5天的LN-229细胞送去生物公司进行了Microarray微阵列基因芯片测序,大数据分析了下调MINA之后基因表达的变化情况。通过基因本体(Gene Ontology,GO)分析KEGG通路分析我们发现,因干扰MINA而下调的基因显著富集在与细胞周期进程相关的基因本体项以及“CDK调控的DNA复制”通路。利用碘化丙啶(propidium iodide,PI)对DNA进行染色,通过流式细胞术甄别细胞所处的周期时期的方法,我们进一步探索了MINA的表达变化对胶质母细胞瘤细胞的周期进程的影响。结果发现,干扰MINA之后的LN-229和U-87 MG细胞周期均在G1期和G2/M期有显著的PI染色峰,其所占比率明显高于对照组,且二者的S期比率明显减少至几乎没有,说明下调MINA之后二者的细胞周期明显阻滞在了G1期和G2/M期,DNA的复制合成明显受到了抑制。并且,在干扰MINA之后再次回复MINA的表达使细胞复制期各阶段的占比回复到了与对照组相近的表型,说明回复MINA成功促使了细胞周期从G1期到S期再到G2/M期的转换。这些结果说明MINA的胶质母细胞瘤细胞周期的进程至关重要。4、MINA通过转录激活Cyclins和CDKs的表达从而调控胶质母细胞瘤细胞周期进程为了对MINA如何调控细胞周期进程的分子机制获得更深入的了解,我们进一步分析了我们的Microarray基因芯片数据,发现下调MINA之后,一些细胞周期蛋白(Cyclins)基因和细胞周期蛋白依赖激酶(CDKs)基因被显著下调,且3天和5天的结果呈现一个时间累积效应。进一步的验证结果显示,下调MINA的表达导致细胞周期相关基因CCNB,CCND,CCNE,CDK1,CDK2和CDK4在m RNA水平显著的下调;下调MINA之后,Cyclin B1,D1,E2和CDK1,CDK2以及CDK4蛋白水平的表达同样受到了显著的抑制。此外,干扰MINA之后再次回复MINA的表达成功反转了这一抑制效应,并显著上调了这些蛋白的表达。Cyclin D/CDK4复合体以及Cyclin E/CDK2复合体为细胞周期从G1期到S期的进程所需,而Cyclin B/CDK1复合体则对细胞周期通过G2/M检查点至关重要。MINA的表达情况直接影响着这些复合体的表达,进一步说明MINA调控胶质母细胞瘤细胞的细胞周期进程。进一步地,我们利用染色质免疫共沉淀(chromatin immunocoprecipitation,Ch IP)结合定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)技术(Ch IP-q PCR),检测MINA能否结合在这些细胞周期相关基因的启动子上。结果发现,和我们的预期一致,MINA分别在CCNE2启动子上的-1408~-1289区域、CDK2启动子上的-476~-366区域、CCND1启动子上的-469~-363区域、CDK4启动子上的-379~-293区域和+604~+762区域以及CDK1启动子的-1094~-1021区域显著富集,其中CCNE2、CDK2、CDK4的富集尤为明显。为了进一步验证我们的结果,我们进行了双荧光素报告系统实验(dual luciferase reporter assay)。结果发现,下调MINA的表达后,CDK2和CDK4启动子的活性明显降低,说明MINA可以增强细胞周期相关基因的启动子活性。上述实验结果证实,MINA通过转录激活Cyclins和CDKs的表达从而调控胶质母细胞瘤细胞周期进程。5、MINA通过其Jmj C结构域介导的H3K9去甲基化调控细胞周期相关基因的表达越来越多的证据表明,组蛋白的表观遗传修饰在基因的转录激活或抑制中扮演重要的角色,我们进一步探索了MINA对细胞周期相关基因表达的转录调控是否与H3K9的去甲基化有关。首先,我们检测了下调MINA之后LN-229细胞的H3K9甲基化状态。Western blot结果显示,下调MINA之后H3K9上的三甲基化水平显著升高,而一甲基化水平显著降低,证明MINA确实可以介导H3K9从三甲基到一甲基的去甲基化。接着,我们删除了维持MINA去甲基化功能必不可少的JmjC结构域,构建了同样具有sh MINA#2靶定抗性的MINAΔJmj C-R。利用缺失-功能性回复/失活回复的手段,我们研究了sh MINA#2、sh MINA#2/MINA-R以及sh MINA#2/MINAΔJmj C-R处理组中H3K9的甲基化状态以及细胞周期关键蛋白的表达情况。结果发现,H3K9me1、Cyclin E2、CDK2以及CDK4的表达水平随MINA的下调而下调,H3K9me3反之,说明MINA的下调阻滞了H3K9由三甲基到一甲基的去甲基化,从而不能激活细胞周期相关蛋白的表达;在干扰MINA后再次回复有功能的MINA反转了这一结果,促使H3K9成功地去甲基化,从而挽救了细胞周期相关蛋白的表达。然而,干扰MINA之后回复Jmj C结构域缺失的MINA突变体却对上述蛋白的表型几乎未产生任何影响,说明MINA依赖其Jmj C结构域行使表观遗传的转录调控功能。6、MINA通过调控细胞周期影响胶质母细胞瘤的生长为了研究MINA在胶质母细胞瘤生长中的作用,我们通过动物实验进行了体内水平的探究。我们利用NOD/SCID荷瘤免疫缺陷小鼠模型进行了皮下成瘤实验。结果显示,与Control对照组相比,下调MINA之后的LN-229细胞成瘤能力明显减弱,肿瘤的生长受到显著抑制,且所成肿瘤的体积和重量的值都远远低于Control对照组;干扰MINA之后再次回复有功能的MINA-R则成功挽救了LN-229细胞的成瘤能力,肿瘤的生长和移植瘤体积及重量都明显得到回复;然而,经过同样的生长时间,干扰MINA之后再次回复去甲基化功能缺失的MINAΔJmj C-R的LN-229细胞则未能反转sh MINA#2 LN-229细胞的成瘤抑制,无论是肿瘤的生长还是移植瘤的体积、重量,均显示显著比Control组和sh MINA#2/MINA-R组更低的水平。这些结果说明MINA对胶质母细胞瘤的体内成瘤及肿瘤生长至关重要,且MINA对胶质母细胞瘤成瘤及肿瘤生长的调控同样依赖其Jmj C结构域所起的功能。为了验证我们研究所得出的体外机制在是否同样适用于体内肿瘤生长过程,我们通过生物学和病理学分析,进一步对体内机制进行了探索与验证。结果显示,体内所生成的移植瘤中蛋白的表达情况与体外培养的胶质母细胞瘤细胞系中蛋白的表达情况一致:与Control对照组相比,下调MINA之后的LN-229所长成的移植瘤中,Cyclin B1、D1、E2,CDK1、2、4以及H3K9me1的表达均显著下调,而H3K9me3的表达显著上升;下调MINA后回复有去甲基化功能的MINA-R成功反转了这一表型;然而下调MINA后回复去甲基化活性缺失的MINAΔJmj C-R则不能反转这一表型;Control组和sh MINA#2/MINA-R组的肿瘤组织比sh MINA#2组和sh MINA#2/MINAΔJmj C-R组的肿瘤组织显示出更加恶性的表征,且肿瘤组织的恶性程度与功能性的MINA表达正相关。此外,功能性MINA的表达还和细胞增殖标记物Ki67的表达正相关,二者呈现同步的变化情况,且与肿瘤组织的恶性程度一致,说明MINA对胶质母细胞瘤的成瘤和生长至关重要,暗示MINA在胶质母细胞瘤中很可能扮演着原癌基因的角色。综上所述,MINA的表达与胶质母细胞瘤患者的预后呈负相关,MINA通过对H3K9的去甲基化转录激活细胞周期关键蛋白的表达,从而促使细胞周期顺利进行,促进胶质母细胞瘤的细胞增殖和肿瘤生长。本研究揭示了MINA在肿瘤的发生、发展中可能扮演的原癌基因角色,为MINA作为新的胶质母细胞瘤的治疗靶标提供了理论基础和现实意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.4

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