水飞蓟素在肺缺血再灌注损伤所致肺血管功能障碍中作用的实验研究

发布时间：2018-03-16 18:26

本文选题：肺缺血再灌注损伤　切入点：内皮功能　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:肺缺血再灌注损伤(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)是一个重要的临床问题,也是困扰临床医生多年的难题,通常发生在肺移植、心肺联合移植、肺栓塞的血管再生治疗、肺动脉成形术、心肺复苏、休克以及各种体外循环心脏手术后等多种临床情况下。近年来,随着医疗技术的不断进步与创新,肺移植已经逐渐成为治疗终末期肺部疾病的有效手段和最终措施。尽管在手术管理和免疫抑制等方面都取得了一定的进展,但肺却极易受到损伤。肺移植在所有脏器移植中的效果并不理想。研究报道,肺移植术后患者一年的生存率仅约为70%,且患者死亡通常发生在术后30天以内。肺移植手术受限源于缺血再灌注损伤引起的高比例原发性移植物功能障碍(primary graft dysfunction,PGD),主要表现为炎症瀑布反应、肺泡损伤和血管通透性增加。对于肺移植受者而言,原发性移植物功能障碍是一种可以导致严重的早期和远期后果的并发症,因此移植团队在选择供体肺方面往往就显得非常保守。原发性移植物功能障碍在很大程度上归因于缺血再灌注损伤,与移植后早期和后期死亡率明显相关,严重的原发性移植物功能障碍(3级)在肺移植术后72h内的发生率约为28.8%。另外,原发性移植物功能障碍也是移植物后期排斥的危险因素,被认为是受者移植后超过1年死亡的主要原因。肺在经历移植之后必然会发生缺血再灌注损伤,引起包括肺血管内皮损伤、微循环障碍以及血液流变学性质改变等在内的肺功能受损表现,甚至导致移植的失败。因此,从肺移植术后缺血再灌注损伤发生的实际情况来看,如何在缺血再灌注损伤发生以前加以干预或保护是改善肺移植短期和长期预后的关键所在。在肺移植过程中,缺血和继发的再灌注是不可避免的,通常会导致移植后急性和(或)无菌性炎症反应,被称为缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusioninjury,IRI)。目前,临床上还没有特效的药物用于防治肺缺血再灌注损伤,而且治疗措施仅限于支持治疗。肺移植的数量每年都在增长,目前的研究方向主要包括:更好地保存供体肺,扩大供体肺池,通过离体肺灌注修复边缘供体肺,以及探索预防或治疗肺缺血再灌注损伤的方法。近年来,国内外许多研究在实验设计时就已经提出了限制肺缺血再灌注损伤的策略,这些策略包括各种抗氧化剂、抗炎药、间充质干细胞以及气体分子通气的应用等,使我们对固有免疫细胞活化、中性粒细胞浸润、内皮屏障功能障碍和氧化应激反应的机制方面有了更进一步的理解与认识。最近的研究确定了多种治疗策略,包括:①抗氧化策略,使用氧自由基清除剂或氧自由基生成酶抑制剂(如亚甲基蓝或N-乙酰半胱氨酸);②抗炎策略,使用促炎转录因子抑制剂(如Egr-1抑制剂)或炎症介质抑制剂(如a1-抗胰蛋白酶、抗细胞因子或抗HMGB1);③使用气体分子通气(如一氧化碳)或吸入具有抗炎特性的麻醉剂七氟烷;④生长因子(如角化细胞生长因子-2);⑤膳食补充剂,如肌酸;⑥以及基于细胞的治疗策略,如间充质干细胞的应用等。此外,最近的一项研究发现用diannexin(人膜联蛋白V的同型二聚体,具有有效抗凝活性的阴离子磷脂结合蛋白)处理可通过减少细胞死亡和组织炎症的机制来显著减轻肺移植模型的缺血再灌注损伤。虽然许多实验研究已经描述了各种方法用以预防或改善缺血再灌注损伤,但这些都还没有转化为临床应用。因此,未来的研究应该旨在更好地理解肺缺血再灌注损伤的机制以确定更有效的治疗靶点,并推动最可行的治疗方法到临床试验。水飞蓟素是从菊科草本植物水飞蓟种子的种皮中提取出来的活性有效成分,具有抗炎、抗氧化应激、维持细胞膜流动性、保护肝细胞膜、促进肝细胞修复和再生等作用,是治疗各类肝脏疾病的传统药物。随着研究的深入,人们还发现水飞蓟素在调节细胞周期、抑制细胞凋亡、免疫调节、神经保护以及对抗脏器缺血再灌注损伤等方面具有重要作用,其临床应用也更加广泛。尽管许多研究均表明水飞蓟素可以通过抗炎、抗氧化以及抑制细胞凋亡等途径减轻多种脏器的缺血再灌注损伤,但是有关水飞蓟素在肺缺血再灌注损伤所致肺血管功能障碍中的作用及机制尚未见报道。为此,本研究拟通过建立大鼠左肺原位热缺血再灌注损伤模型,观察水飞蓟素在肺缺血再灌注损伤所致肺血管功能障碍中的作用,并探讨其可能机制。第一部分肺缺血再灌注损伤对肺血管功能的影响目的:通过建立大鼠左肺原位热缺血再灌注损伤模型,观察肺缺血再灌注损伤对离体肺动脉舒张功能的影响。方法:健康雄性SD大鼠20只,随机分为对照组(S组)和缺血再灌注组(IR组)(n=10)。IR组建立大鼠左肺原位热缺血再灌注损伤模型,阻断左侧肺门60min后松开结扎线,形成再灌注;S组大鼠完全按照同样的外科手术步骤进行操作,只是未做左侧肺门结扎。在恢复血流灌注24h后,放血处死大鼠,取左肺组织备用。在体视显微镜下分离左肺二级肺内动脉,并将其剪切成长度约为2.5mm的肺动脉环;根据实验需要将一部分肺动脉环用人类发丝轻刮动脉管腔去除血管内皮,制备内皮剥除的肺动脉环。采用乙酰胆碱的累积舒张反应曲线法分别测试内皮完整和内皮剥除离体肺动脉环的舒张功能,以明确内皮依赖性肺动脉舒张功能变化;采用硝酸甘油的累积舒张反应曲线法分别测试内皮完整和内皮剥除离体肺动脉环的舒张功能,以明确非内皮依赖的舒张功能变化。结果:1.乙酰胆碱诱发的离体肺动脉环舒张反应1.1内皮完整时,S组乙酰胆碱诱发的肺动脉环舒张反应曲线在1×10-9～1×10-7浓度范围时呈缓慢上升趋势,当累积浓度达到3×10-7时,舒张反应曲线迅速上升,随后舒张反应曲线的上升趋势又趋于平缓,显示肺动脉环舒张功能良好;IR组乙酰胆碱诱发的舒张反应曲线总体上升趋势较为平缓,显示肺动脉环舒张功能降低。与S组比较,IR组乙酰胆碱诱发的肺动脉环舒张功能显著降低(P0.01)。1.2内皮剥除后,S组和IR组乙酰胆碱诱发的肺动脉环舒张反应曲线虽然均呈缓慢上升趋势,但总体却较为平直,显示两组肺动脉环舒张功能均明显降低;组间比较差异无统计学意义(P0.05)。2.硝酸甘油诱发的离体肺动脉环舒张反应2.1内皮完整时,S组和IR组硝酸甘油诱发的肺动脉环舒张反应曲线在1×10-9～1×10-7浓度范围时均呈缓慢上升趋势,当累积浓度达到3×10-7时,舒张反应曲线均迅速上升,从1×10-5开始舒张反应曲线的上升趋势又都趋于平缓,显示两组肺动脉环舒张功能良好;组间比较差异无统计学意义(P0.05)。2.2内皮剥除后,S组和IR组硝酸甘油诱发的肺动脉环舒张反应曲线的变化趋势与内皮完整时基本一致,显示两组肺动脉环舒张功能良好;组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:肺缺血再灌注损伤可显著损害内皮依赖性肺动脉舒张功能,而不是非内皮依赖性舒张,导致肺动脉舒张功能障碍。第二部分水飞蓟素在肺缺血再灌注损伤所致肺血管功能障碍中的作用目的:通过建立大鼠左肺原位热缺血再灌注损伤模型,观察水飞蓟素预处理对缺血再灌注肺组织炎性反应、氧化应激、caspase-3/9活性、HIF-1α和iNOS蛋白表达以及肺动脉舒张功能障碍的影响,明确水飞蓟素在肺缺血再灌注损伤所致肺动脉舒张功能障碍中的作用,并探讨其潜在机制。方法:健康雄性SD大鼠被随机分为对照组(S组)、缺血再灌注组(IR组)和水飞蓟素预处理组(SM组)(n=10),IR组和SM组的大鼠均按照第一部分中的方法建立左肺原位热缺血再灌注损伤模型。其中,SM组的大鼠,术前连续8天以灌胃的方式给予水飞蓟素250mg/kg/d(用生理盐水稀释至2ml);S组和IR组大鼠,用完全相同的方式给予等容量的生理盐水。在恢复血流灌注24h后,放血处死大鼠,留取左肺组织标本待测。计算肺组织湿/干重比值(W/D);采用酶联免疫吸附法测定肺组织中NF-1κB、TNF-α、IL-6和IL-1Β的含量;硫代巴比妥酸比色法检测肺组织中MDA的含量;黄嘌呤氧化酶法检测肺组织中SOD的活性;分光光度法检测肺组织中Caspase-9和Caspase-3的活性;Western blotting法检测肺组织中HIF-1α和iNOS蛋白的表达;采用乙酰胆碱的累积舒张反应曲线法测试离体肺动脉环的舒张功能变化。结果:1.三组大鼠肺组织W/D的比较:与S组相比,IR组和SM组肺组织W/D均显著增加(P0.01);与IR组比较,SM组肺组织W/D明显降低(P0.01)。2.三组大鼠肺组织炎性反应的比较:与S组相比,IR组和SM组肺组织中NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1Β含量均显著增加(P0.01);与IR组比较,SM组肺组织中NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1Β含量明显降低(P0.01)。3.三组大鼠肺组织氧化应激反应的比较:与S组相比,IR组和SM组肺组织中MDA含量均明显增加,SOD活性均显著降低(P0.01);与IR组比较,SM组肺组织中MDA显著降低,SOD活性明显增加(P0.01)。4.三组大鼠肺组织Caspase-3和Caspase-9活性的比较:与S组比较,IR组和SM组肺组织中Caspase-3和Caspase-9活性均明显增加(P0.01);与IR组比较,SM组肺组织中Caspase-3和Caspase-9活性显著降低(P0.01)。5.三组大鼠肺组织HIF-1α和iNOS蛋白表达的比较:与S组比较,IR组和SM组肺组织中HIF-1α和iNOS蛋白表达均明显增加(P0.01);与IR组比较,SM组肺组织中HIF-1α和iNOS蛋白表达明显降低(P0.01)。6.三组大鼠离体肺动脉环舒张反应的比较:三组大鼠离体肺动脉环乙酰胆碱诱发的舒张反应曲线在1×10-9～1×10-7浓度范围时均呈缓慢上升趋势,当累积浓度达到3×10-7时,三组肺动脉环舒张反应曲线均迅速上升,其中S组上升幅度最大、SM组次之、IR组最小,随后舒张反应曲线的上升趋势又趋于平缓,显示S组肺动脉环舒张功能良好、SM组次之、IR组最差。三组组间比较:与S组比较,IR组和SM组肺动脉环舒张功能显著降低(P0.01);与IR组相比,SM组肺动脉环舒张功能显著改善(P0.01)。结论:水飞蓟素可显著改善肺缺血再灌注损伤所致内皮依赖性肺动脉舒张功能障碍,其机制可能与其抗炎、抗氧化应激、抑制细胞凋亡以及调节HIF-1α-iNOS信号通路有关。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R655.3

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