双歧杆菌介导CTP-NPRL2治疗裸鼠肾癌的分子机制研究

发布时间：2018-03-17 14:32

本文选题：肾癌　切入点：NPRL2　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肾癌发源于泌尿小管上皮,是成人中常见的恶性肿瘤之一。早期可以手术切除,但术后一部分患者仍然发生转移,晚期则失去手术根治机会,并且缺乏特效治疗方法。虽然细胞因子及分子靶向药物等对肾癌有一定的疗效,但总体效果均不够理想。而恶性肿瘤的发生发展与基因的功能改变密切相关,因此探索基因疗法具有积极意义,也是肾癌治疗的长期研究热点。NPRL2(nitrogen permease regulator-like 2)是近年来新发现与热点研究的抑癌基因之一,与许多肿瘤的发生发展及预后关系密切。课题组前期发现NPRL2在肾癌组织中的表达较癌旁正常组织明显下降,转染外源性NPRL2基因对肾癌细胞具有明显的抑制作用,提示NPRL2在肾癌的发生发展中扮演了重要的角色。但利用传统的转基因技术将外源基因导入肿瘤宿主细胞,存在转染效率低、基因突变及丢失等一系列问题,而新的转导肽CTP可高效携带蛋白质穿透胞膜并专性定位于胞浆,提供了解决问题的可能性。在基因治疗研究中,应用的载体系统主要有病毒和非病毒(脂质体等)两大类,前者存在病毒滴度低、缺乏安全性与引起突变等缺点,后者也存在缺乏肿瘤靶向性、转染效率低等缺点,而双歧杆菌为肠道重要的厌氧益生菌,对肿瘤低氧区具有特异靶向性,是一种良好的肿瘤基因治疗靶向载体。本课题在前期基础之上对抑癌基因NPRL2进行深一步的研究,利用CTP显著的胞浆定位与高效的转导潜能,率先提出了“通过NPRL2与CTP融合表达来实现外源性NPRL2蛋白?内源化?”的策略。通过原核表达CTP-NPRL2融合蛋白,利用CTP的转导功能将NPRL2蛋白转入肾癌细胞后观察细胞生物学行为的改变,同时以双歧杆菌为载体在裸鼠肾癌模型上进行实验以评估疗效,最终运用基因芯片、蛋白质谱等技术初步揭示双歧杆菌介导CTP-NPRL2治疗裸鼠肾癌的分子机制,以期为肾癌寻找到一种新的基因治疗方法。本论文总共分两部分。第一部分CTP转导NPRL2蛋白对人肾癌细胞786-O生物学行为的影响目的:证实CTP能够转导NPRL2蛋白进入人肾癌细胞786-O并对该细胞的生物学行为产生影响。方法:1.构建重组质粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2并分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导蛋白表达并Western blot验证。2.FITC分别标记CTP-NPRL2和NPRL2两种蛋白,激光共聚焦显微镜观察蛋白在细胞中的定位,FACS检测转导效率。3.根据作用蛋白的不同将实验分为CTP-NPRL2组、NPRL2组及空白对照组,每组均处理786-O,CCK-8法检测细胞增殖,FACS检测细胞周期与凋亡,Transwell法检测细胞侵袭及迁移能力。结果:1.重组质粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经Western blot验证能够表达出目的蛋白。2.激光共聚焦显微镜显示CTP-NPRL2组细胞内可见绿色荧光并显著定位于胞浆,而NPRL2组及空白对照组未见绿色荧光。FACS显示CTP-NPRL2融合蛋白以75%左右的高效率转入肾癌细胞786-O,而NPRL2蛋白几乎不能进入该细胞。3.与NPRL2组及空白对照组相比,CCK-8检测发现CTP-NPRL2组细胞增殖能力明显减弱(P0.05),FACS显示CTP-NPRL2组的凋亡率显著增高(P0.01)且处于G0/G1期细胞明显增多(P0.05),Transwell显示CTP-NPRL2组细胞侵袭及迁移能力明显降低(P0.01)。同时CTP-NPRL2融合蛋白随其浓度增加而作用增强。NPRL2组与空白对照组以上比较均无显著性差异(P0.05)。结论:CTP能够高效转导NRPL2蛋白进入肾癌细胞786-O并对该细胞产生肿瘤抑制作用,并且随CTP-NPRL2融合蛋白浓度增加而作用增强。第二部分双歧杆菌介导CTP-NPRL2治疗裸鼠肾癌的疗效及机制研究目的:探讨双歧杆菌介导CTP-NPRL2治疗裸鼠肾癌模型的疗效,并利用基因芯片与蛋白质谱检测结果综合分析的策略探索相应的分子机制,以期从整体水平上揭示该治疗方法的作用原理,并筛选出关键性的靶基因。方法:1.786-O细胞悬液皮下注射法构建裸鼠肾癌模型,通过病理切片证实模型是否构建成功。2.厌氧法培养婴儿双歧杆菌,电转法将重组质粒p ET15b-CTPNPRL2、p ET15b-NPRL2及空质粒转化感受态双歧杆菌,Western blot验证目的蛋白的表达。3.将建模成功的裸鼠肾癌模型40只按处理因素不同随机分为5组:双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组、双歧杆菌+p ET15b-NPRL2组、双歧杆菌+p ET15b组、双歧杆菌组与生理盐水组,每组8只,尾静脉注射各菌液或生理盐水,每周1次,共4次。4.通过观察裸鼠重量、瘤体重量、双肾重量及TUNEL检测肿瘤组织凋亡情况以评估疗效。5.基因芯片与蛋白质谱检测分别寻找经双歧杆菌介导CTPNPRL2处理后的裸鼠肾癌组织差异表达基因与蛋白,并进行GO、Pathway、Pathway-network等生物信息学分析,结合阅读文献,推断双歧杆菌介导CTP-NPRL2治疗裸鼠肾癌的分子机制。6.筛选出可能的靶点基因,Real time-PCR、Western blot验证表达。7.选取代表性的靶基因,构建3条针对该基因的干扰si RNA序列以及1条无义si RNA序列,Real time-PCR筛选最适干扰si RNA序列;构建针对该基因的重组质粒。8.探讨代表性靶基因对786-O生物学行为的影响,将实验分为干扰si RNA组、无义si RNA组、空白对照组、重组质粒组与空质粒组,处理786-O细胞,Real time-PCR和Western Blot检测每组代表性基因的表达,CCK-8法检测细胞增殖,FACS检测细胞周期与凋亡。结果:1.裸鼠皮下生长出肿块并经病理切片证实为肾癌。2.电转重组质粒p ET15b-CTP-NPRL2、p ET15b-NPRL2及空质粒后双歧杆菌能够良好生长,经Western blot验证表达出目的蛋白。3.双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组裸鼠重量明显改善,瘤体重量减轻,与其余任意一组相比具有显著差异(均P0.01),而剩余各组之间无明显差异(均P0.05),双肾重量在各组间亦无明显差异(均P0.05)。双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组凋亡率(26.8±4.15)%与生理盐水组凋亡率(11.6±3.58)%有显著差异(P0.01)。4.基因芯片筛选出双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组与生理盐水组肾癌组织差异表达2倍以上基因565个,其中313个在双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组表达上调,252个表达下调;GO分析显著富集的Term中与肿瘤相关的有:细胞增殖、细胞迁移、细胞移动、细胞增殖的调控、细胞迁移的调控等;Pathway分析显著富集的Term中与肿瘤相关的有:细胞外基质组建、G0/G1早期、整合素介导的细胞表面相互粘附、细胞周期等;Pathway-network分析处于中心地位的Term为:MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞周期。5.蛋白质谱筛选出双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组与生理盐水组肾癌组织表达差异1.5倍以上蛋白560个,其中79个在双歧杆菌+p ET15b-CTP-NPRL2组表达上调,481个表达下调;GO分析显著富集的Term中与肿瘤相关的有:细胞外膜泡小体、Rac信号转导、翻译起始、细胞外基质成分等;Pathway分析显著富集的Term中与肿瘤相关的有:β1整合素细胞表面相互作用、Ras通路、C-MYB转录因子网络、胶原降解等;Pathway-network分析处于中心地位的Term为:MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路。6.选取出四个与肿瘤发生发展密切相关基因:ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2。Real time-PCR验证结果显示双歧杆菌+p ET15bCTP-NPRL2组ANXA1表达增高约1.86倍,而TIAL1、PRMT1、ANGPTL2基因表达分别下降约1.77、2.24、19.56倍;Western blot验证结果基本一致。7.选取出差异倍数最大的ANGPTL2进行细胞生物学功能验证,CCK-8显示重组质粒组细胞增殖明显增加,干扰si RNA组细胞增殖明显减少。8.FACS显示各组细胞凋亡率分别是(10.06±0.27)%、(2.93±0.30)%、(2.99±0.11)%、(1.98±0.11)%、(3.13±0.08)%。重组质粒组与其余任意一组相比有显著性差异(均P0.01),同理干扰si RNA组;而其余三组任意两组相比无显著性差异(均P0.05)。各组处于G0/G1期的细胞比例分别是(69.32±2.45)%、(54.89±0.48)%、(54.22±2.7)%、(46.57±0.13)%、(56.05±4.29)%。重组质粒组与其余任意一组相比有显著性差异(均P0.01),同理干扰si RNA组;而其余三组任意两组相比无显著性差异(均P0.05)。结论:1.双歧杆菌-CTP-NPRL2能够抑制裸鼠肾癌的生长,增加肾癌组织的凋亡并改善裸鼠体重。2.双歧杆菌-CTP-NPRL2调节了包括ANXA1、PRMT1、TIAL1、ANGPTL2在内的一些与肿瘤发生发展密切相关基因的表达,这些基因涉及癌基因、抑癌基因、增殖与凋亡相关基因、细胞周期相关基因、血管生长基因等。3.ANGPTL2具有癌基因功能,过表达能够促进肾癌细胞786-O的增殖、减少凋亡,而抑制表达则降低该细胞的增殖、增加凋亡;同时抑制ANGPTL2表达能阻滞肾癌细胞786-O细胞周期于G0/G1期,反之则结果相反。4.在双歧杆菌-CTP-NPRL2调节的与肿瘤发生发展密切相关的基因中,对ANGPTL2基因表达的抑制发挥了重要作用。5.双歧杆菌-CTP-NPRL2可能主要通过MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路来发挥对裸鼠肾癌的抑制功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.11

【相似文献】