LSD1调控结肠癌侵袭转移相关基因的筛选及鉴定

发布时间：2018-03-19 05:40

本文选题：结肠癌　切入点：赖氨酸特异性去甲基化酶1　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分LSD1表观遗传修饰的与转移相关的下游靶基因的筛选目的:利用人类基因表达谱芯片和Ch IP技术探测结肠癌细胞中LSD1调控的下游靶基因,为后续实验做好准备。方法:(1)细胞系培养:人结肠癌细胞株SW620、HT-29细胞来源于中南大学湘雅医学院细胞研究中心。10%胎牛血清的L-15培养基作为SW620细胞的培养液;10%胎牛血清的RPMI1640培基作为HT-29细胞的培养液。(2)细胞转染及分组:构建、合成LSD1过表达载体及si RNA-LSD1有效片段,脂质体2000介导转染LSD1-si RNA入SW620细胞,脂质体2000介导转染LSD1过表达载体入HT-29细胞。将实验细胞分为6组,A组:结肠癌细胞株SW620,B组:SW620+negative control(NC),C组:稳定转染LSD1-si RNA的SW620细胞(SW620+LSD1-si RNA),G1组:结肠癌细胞株HT-29,G2组:HT-29+negative control(NC),G3组:稳定转染LSD1-overexpression的HT-29细胞(HT-29+LSD1-overexpression)。(3)利用人类基因表达谱芯片获取LSD1高表达导致的结肠癌细胞基因表达改变集:通过对六个实验细胞组进行基因芯片检测。根据log2(ratio)与p-value(Differentially expressed)的大小可挑选有显着差异表现的探针确定差异表达基因{有显著差异表达的条件为|log2(Ratio)|=1 and P-value(Differentially expressed)0.05}。(4)Real-time PCR及Western blot验证:随机选取其中10个靶基因,利用Real-time RT-PCR、Western Blot在结肠癌细胞SW620、HT-29细中验证是否与基因表达谱芯片分析结果吻合。(5)利用生物信息学技术确定与转移相关的靶基因,利用Gene Ontology的分类和聚类分析,按照其参与的生物学过程(Biological Process)和分子功能(Molecular Function)进行了功能分类,确定与转移相关的靶基因。再利用Pathway Studio数据库分析每个因子的作用通路,显示LSD1及转移相关的靶基因在已知信号通路中的位置,揭示LSD1与靶基因在整个信号通路中的相互作用关系,并选择最有意义的基因进行后续研究。结果:(1)基因表达谱芯片分析结果显示,具备筛选标准(筛选条件为log2|Fold change|≥1且P0.05)的差异表达基因共有8275个,其中明显上调的基因有3633个,基因明显下调的差异表达基因有4642个。为保证结果的可靠性,进一步使LSD1基因在结肠癌细胞株HT-29中过表达(稳定转染LSD1基因的全长c DNA序列至HT-29细胞),重复上述实验,验证上述差异表达的基因,结果显示,符合筛选标准(同上)的差异表达基因共有8287个,其中4047个基因明显上调,4240个基因明显下调。(2)通过进一步筛选我们得到1528个在实验组和对照组表达差异在3倍以上的基因,在sw620细胞中,实验组(C/A)及对照组(C/B)同时表达的差异表达基因数为101个(log2|Fold change|≥3且P0.05)。在HT-29细胞中,实验组(G3/G1)和对照组(G3/G2)同时表达的差异表达基因数为106个(log2|Fold change|≥3且P0.05)。在实验组(C/A)中差异表达基因为高表达(或低表达),同时在实验组(G3/G1)中为低表达(或高表达)的差异表达基因数为20个(log2|Fold change|≥3且P0.05)。通过比对分析,我们筛选出以下20个LSD1调控的下游靶基因:CDH1、ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14、VAV1、AKR1B1、CENPA、F2R、NFIB、NR4A2、MAGEA6|MAGEA3、CABYR、FOXF2、NELL2、TLE4、COPZ2、SLC9A2、STAP-2。(3)Real-time PCR实验验证结果表明下游靶基因CABYR、FOXF2、NELL2和TLE4在实验组SW620+LSD1-si RNA中m RNA高表达(P0.05),在实验组HT-29+LSD1-overexpression中m RNA低表达(P0.05)。而下游靶基因ADGRF1、BDNF、CD40、EREG、S100A14和VAV1则在实验SW620+LSD1-si RNA中m RNA显著低表达(P0.05),在实验组HT-29+LSD1-overexpression中m RNA显著高表达(P0.05),结果表明靶基因在转录水平RNA的相对表达量变化趋势与芯片筛选的差异表达基因相对表达量变化趋势相一致。在蛋白水平上的实验结果证实目的基因的Western blot蛋白表达结果重复了基因芯片结果的变化趋势。以上验证结果表明芯片筛选结果是准确可靠的。(4)对差异表达倍数排序前十的差异表达基因进行Gene Ontology和Pathways显著性分析,结果显示在GO注释与功能分类报告对应的差异表达基因中,与分子功能相关有6930条;与生物学过程相关的有2878条;和细胞组分有关的有7306条;在分子功能中,87.27%的差异表达基因与苷酸结合相关,其次为ATP结合相关,转录因子结合相关;在生物学过程中,有59.97%的差异表达基因与细胞内分子及蛋白质分解代谢相关的,另外比例较高的有细胞凋亡、细胞周期等;在细胞组分方面,29.65%的差异表达基因与非膜结合细胞器相关,细胞膜相关占16.25%;KEGG信号通路富集分析,表明排序前十的差异表达基因主要参与p53信号通路、癌症信号通路、泛素调节的蛋白质降解、轴突导向信号通路、氨基酰-t RNA合成酶、小细胞肺癌、细胞周期、嘧啶代谢、B细胞受体信号通路、慢性粒细胞白血病。(5)利用生物信息学技术(Gene Ontology,Pathway studio)进一步确定LSD1调控的影响结肠癌侵袭转移的,并与结肠癌细胞增殖、凋亡、肿瘤的发生相关的靶基因。并选择了相应的具有代表性意义的4个基因CABYR、FOXF2、TLE4、CDH1进行后续的研究。结论:(1)利用基因表达芯片对靶向沉默LSD1基因的SW620结肠癌细胞、稳定转染LSD1-过表达载体的HT-29细胞进行基因检测。在这两种癌细胞株中探测到大量差异表达的基因(明显上调或下调),提示LSD1调控的下游靶基因在结肠癌转移的过程中可能发挥重要作用。(2)确定了能影响结肠癌侵袭转移的靶基因即可确定为结肠癌中受LSD1表观遗传修饰的与转移相关的下游靶基因。通过比对分析在结肠癌细胞株中筛选出的CABYR、FOXF2、TLE4、CDH14个基因的差异表达与结肠癌的侵袭转移密切相关,为后面的研究奠定基础。第二部分探讨LSD1调控结肠癌侵袭转移的分子机制目的:探讨结肠癌细胞是否通过改变LSD1与其下游靶基因的结合丰度,继而下调靶基因启动子区域H3k4、H3k9的甲基化水平而影响靶基因的表达,结合人类基因表达谱芯片分析结果,进一步确定LSD1表观遗传修饰的下游靶基因。从而初步阐明LSD1影响结肠癌侵袭转移的分子机制,探讨LSD1调控表观遗传修饰的可能机制。方法:选择前期研究筛选出的4个靶基因(CABYR、FOXF2、T LE4、CDH1)利用LSD1、H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me单克隆抗体,分离出与其结合的潜在LSD1下游靶基因启动子,PCR检测该启动子区域,普通半定量PCR的强度代表目的基因启动子的丰度,同时也代表H3K4me2、H3K4me、H3K9me2、H3K9me强度。通过染色质免疫共沉淀(Ch IP)技术分别检测每个靶基因的6个实验组即A.SW620细胞(空白对照),B.SW620细胞+NC-si RNA(阴性照),C.SW620细胞+LSD1-si RNA,G1.HT-29细胞(空白对照),G2.HT-29细胞+NC空白载体(阴性对照),G3.HT-29细胞+LSD1过表达载体,检测内容包括:(1)LSD1与其下游靶基因启动子区域的结合丰度;(2)LS D1下游靶基因启动子区域组蛋白H3第4位赖氨酸的二甲基(H3K4m e2)和一甲基(H3K4me)水平,以及组蛋白H3第9位赖氨酸的二甲基(H3K9me2)和一甲基(H3K9me)水平。结果:(1)LSD1与下游靶点靶基因启动子结合的分析结果:LSD1低表达组(LSD1-si RNA)和LSD1过表达组(HT-29+LSD1-overexp ression)均与靶基因CABYR的启动子区域结合能够产生DNA-蛋白复合体,且下调LSD1可增加目的基因CABYR的表达水平,增加幅度比较明显(P0.01),而过表达LSD1可降低目的基因CABYR的表达水平。低表达LSD1组(LSD1-si RNA)和过表达组(HT-29+LSD1-overexpression)均与靶基因CDH1(E-cad)的启动子区域结合能够产生D NA-蛋白复合体,且结果提示低表达LSD1可一定程度上增加目的基因CDH1的表达水平(P0.01),过表达LSD1可降低目的基因CDH1的表达水平。结果显示,靶基因FOXF2、TLE4的CHIP组未见条带,上调或下调LSD1均对目的基因FOXF2、TLE4的表达水平无明显影响,即LSD1可能并未直接调控FOXF2、TLE4基因。(1)下游靶基因表达水平与组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平结果分析:低表达LSD1组(LSD1-si RNA)明显增加靶基因CABYR启动子区H3K4me2甲基化程度(P0.01),低表达LSD1对CABYR启动子区域H3K4me、H3K9me/2甲基化无影响。低表达LSD1明显增加靶基因CDH1(E-cad)启动子区H3K4me2甲基化程度(P0.01),而对CDH1(E-cad)启动子区域H3K4me、H3K9me/2甲基化无影响。过表达组(HT-29+LSD1-overexpression)对下游靶基因启动子区域H3K4me1/2甲基化有明显作用,过表达LSD1明显降低靶基因CABYR启动子区H3K4me1(P0.05)、H3K4me2(P0.01)甲基化程度,上调LSD1对CABYR启动子区域H3K9me/2甲基化无影响。上调LSD1显降低靶基因CDH1(E-cad)启动子区H3K4me2甲基化程度(P0.01),对CDH1(E-cad)启动子区域H3K4me、H3K9me/2甲基化无影响。CHIP结果显示,上调或下调LSD1并不改变靶基因FOXF2和TLE4总的H3K9me1/2与H3K4me1/2的甲基化水平。结论:(1)在人结肠癌细胞株SW620细胞中,LSD1与其表观遗传修饰的下游靶基因CABYR和CDH1(E-cad)基因启动子区组蛋白H3K4me2甲基化水平呈负相关,而在HT-29人结肠癌细胞株中LSD1与其表观遗传修饰的下游靶基因CABYR基因启动子区组蛋白H3K4me1/2甲基化水平呈正相关,与CDH1(E-cad)基因启动子区组蛋白H3K4me2甲基化水平呈正相关。同时证明了CABYR和CDH1(E-cad)基因为与转移相关的靶基因,其表达的上调或下调可能是影响结肠癌转移的原因。(2)阐明了结肠癌细胞是通过改变LSD1与其下游靶基因的结合丰度,继而下调靶基因启动子区域H3K4me1、H3K4me2的甲基化水平而影响靶基因的表达,这为进一步研究LSD1影响结肠癌侵袭转移的分子机制奠定了基础。第三部分验证LSD1调控转移相关靶基因对结肠癌细胞侵袭能力的影响目的:在细胞水平验证转移相关靶基因对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响,通过验证的能影响结肠癌侵袭转移的靶基因即可确定为结肠癌中受LSD1表观遗传修饰的与转移相关的下游靶基因。方法:分别利用侵袭性较强的SW620细胞进行验证,各自分为为3个组,未处理组(blank)、阴性对照组(scramble)和处理组(转染si RNA),即以未转染的SW620细胞(A组)和转染空载体SW620细胞组(B组:SW620细胞+转染空载体组)作为对照,处理组(C组:SW620细胞+si RNA-CABYR/CDH1)通过转染si RNA沉默靶基因的表达,利用Transwell细胞体外迁移/侵袭实验验证转移相关靶基因对结肠癌细胞迁移、侵袭能力的影响。结果:在通过沉默靶基因(si RNA-CABYR)处理的结肠癌SW620细胞中,与阴性对照处理组细胞相比,其侵袭能力(40.00±4.06vs 69.50±2.25,68.50±5.02;P0.05)均显著减弱。在通过沉默靶基因(si RNACDH1)处理的结肠癌SW620细胞中,与阴性对照处理组细胞相比,其侵袭能力(116.25±4.38vs 59.50±3.84,58.25±4.82;P0.05)均显著增强。转染si RNA-CABYR基因组结肠癌SW620细胞与对照组(未经转染组和空质粒组)细胞相比较,其侵袭能力有减弱。转染si RNA-CDH1基因组结肠癌SW620细胞与对照组(未经转染组和空质粒组)细胞相比较,其侵袭能力有增强。结论:Transwell实验结果证明沉默靶基因CABYR在体外显著抑制SW620结肠癌细胞的侵袭性;沉默靶基因CDH1在体外显著增SW620结肠癌细胞的侵袭性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35

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