核定位碳酸酐酶6B通过PRMT5表观机制促进天然免疫白细胞介素12产生的研究

发布时间：2018-03-20 04:29

本文选题：Car6-b　切入点：IL-12　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：正常的免疫应答反应对于机体的自我保护至关重要。机体通过天然免疫应答识别入侵病原体(病毒、细菌及真菌)或者细胞内危险信号模式分子,激活细胞引起炎症反应在内的一系列信号转导通路,启动天然免疫反应及后期的适应性免疫反应。这个免疫应答过程由许多免疫器官、免疫细胞和免疫分子共同参与。在参与免疫应答反应的多种分子中,白细胞介素12(interleukin 12,IL-12)是一种关键的促炎细胞因子,它主要由活化的巨噬细胞(macrophages)和树突状细胞(dendritic cells,DCs)产生,并进一步诱导Th1辅助性淋巴细胞和自然杀伤细胞(Natural Killer cells,NK cells)分泌干扰素γ(interferon γ,IFN-γ),从而保护机体抵抗病原体感染,特别是胞内细菌的感染。由此可见,IL-12通过其自身作用将机体天然免疫屏障和后续的适应性免疫应答相互关联,是天然免疫和适应性免疫的桥梁分子。IL-12由IL-12p35和IL-12p40两个亚基组成。IL-12家族共有3个成员,除了IL-12之外,另一个成员是白细胞介素23(interleukin 23,IL-23),由与IL-12有相同的亚基IL-12p40和IL-23p19组成;还有一个成员是白细胞介素27(interleukin 27,IL-27),由 EB 病毒诱导基因 3(Epstein-Barr virus-induced gene 3,EBI3)和 IL-27p28组成。IL-12在免疫应答反应中发挥着重要作用,然而,有关IL-12表达调控的机制目前尚未完全阐明。我们通过本研究首次表明IL-12可以被碳酸酐酶6B(carbonic anhydrase6Btype,Car6-b,编码 CA-VIB)调控表达的新机制。E-selectin(由Sele编码)是血管内皮细胞的粘附因子,介导白细胞的粘附和迁移。我们在前期研究工作发现E-selectin不仅介导白细胞的游出,还通过促进巨噬细胞中干扰素γ受体β亚基(IFNγR2)在细胞膜的表达,参与巨噬细胞的活化过程。我们通过对Sele敲除小鼠(SelS-/-)和对照组小鼠(Sele+/+)腹腔注射李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)后,取体内刺激第三天的腹腔巨噬细胞进行芯片分析发现,Car6在Sel-/-腹腔巨噬细胞中的表达显著下降,因此提示Caar6在天然免疫反应中可能具有一定的功能。碳酸酐酶(carbonicanhydrases,CAs)广泛存在于哺乳动物中,属于a-碳酸酐酶。CAs是含锌离子(Zn2+)的金属酶,可以催化二氧化碳(carbon dioxide)发生水合反应,对于pH调控和体内稳态具有重要作用。目前,鉴定出13种具有碳酸酐酶活性的同工酶,其中,只有CA-Ⅵ是分泌型表达的碳酸酐酶,分泌到唾液和乳汁中。CA-Ⅵ蛋白有两种亚型:一种是分泌型的A型Car6(Car6-a,编码CA-VⅥA),另一种是定位在细胞内的B型Car6(Car6-b,编码CA-ⅥB)。目前为止,该家族成员是否参与天然免疫应答反应尚没有报道。我们首先对Car6在免疫细胞中的表达谱进行分析,发现只有Car6-b表达在免疫细胞中,特别是在巨噬细胞中高表达。为了进一步研究Car6-b在天然免疫反应中的作用,我们首先在体外培养的原代巨噬细胞中使用siRNA干扰技术下调Car6-b的表达,之后分别用李斯特菌或者脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,发现IL-12的表达量在Car6-b下调表达后的细胞内显著降低。我们随后用CRISPR-Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9)体系构建Car6敲除的小鼠,通过体内感染李斯特菌模型,发现Car6表达缺失后,IL-12的产生受到显著抑制,小鼠清除李斯特菌能力也显著降低,导致Car6敲除小鼠在感染李斯特菌后生存率显著低于野生型小鼠。我们进一步探讨了Car6如何特异性调控IL-12的表达,结果表明,核定位的CA-VIB通过与蛋白精氨酸甲基化转移酶 5(protein arginine N-methyltransferase 5,PRMT5)相互作用,从而减少Il12启动子区组蛋白H3第8位精氨酸对称性二甲基化(H3R8me2s)修饰,进而促进Il12启动子区染色质的开放状态,促进转录因子c-Rel与Il12b启动子区的结合,最终选择性促进IL-12的表达。我们的研究揭示了一种全新的IL-12表达的调控机制,即碳酸酐酶6B可以通过与PRMT5相互作用以表观修饰的机制促进IL-12的表达。这一结果首次提出了Car6-b在天然免疫中发挥促进作用,为感染性疾病的研究和治疗提供新的潜在靶点和研究思路。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R392

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