三氟拉嗪对系膜细胞增殖的影响及作用机制的研究

发布时间：2018-03-21 03:07

本文选题：三氟拉嗪　切入点：系膜细胞　出处：《山西医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：系膜细胞异常增殖将引起细胞外基质的增多,导致肾小球硬化,多数患者甚至将不可逆的进展为终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)。因此,抑制系膜细胞的过度增殖成为增生性肾小球疾病的治疗靶点。本课题组从2010年开始研究了三氟拉嗪对人系膜细胞的体外作用效果及相关机制,同时观察了三氟拉嗪(trifluoperazine,TFP)对狼疮肾小鼠体内系膜细胞的作用效果及机制,并进一步研究了三氟拉嗪联合环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对系膜增生性疾病的治疗效果。第一部分三氟拉嗪抑制体外和体内系膜细胞的异常增殖目的:研究三氟拉嗪对体内外系膜细胞增殖的影响。方法:(1)体外实验采用MTT、台盼蓝细胞计数法检测各组细胞增殖的情况。(2)体内实验HE、PAS、MASSON染色后观察各组肾脏系膜细胞增生情况;免疫组化和Western Blotting方法检测各组Ki67和细胞增殖核抗原(PCNA)的表达;采用ELISA方法检测各组动物血肌酐,尿素氮水平,比较各组小鼠肾功能的情况。结果:(1)体外实验MTT结果显示,高浓度的血清即20%FBS组可以刺激系膜细胞的过度增殖,该效应呈时间和剂量依赖性。TFP处理后,细胞增殖能力显著下降,且该效应呈剂量及时间依赖性;(2)体内实验HE,PAS和MASSON染色结果显示,狼疮性肾炎组(Lupus Nephritis,LN)小鼠较正常组(Normal,N)有明显的病理改变,实验组(ln+tfp)较ln组系膜细胞增生程度减低。这一结果也在ki67和pcna的免疫组化及westernblotting的研究中得到了验证。elisa结果显示,ln组血肌酐,尿素氮水平明显高于normal组,给药tfp后两组水平均降低。结论:三氟拉嗪可以抑制体内外系膜细胞的异常增殖,并可以改善系膜增生性狼疮肾小鼠的肾功能。第二部分三氟拉嗪对系膜细胞细胞周期的影响及机制的研究目的:探讨三氟拉嗪对系膜细胞细胞周期的影响及机制。方法:(1)体外实验通过流式细胞仪检测各组细胞的周期分布,然后根据此流式分析结果,通过westernblotting方法考察相关周期蛋白的变化。(2)体内实验采用westernblotting方法进一步验证tfp在体内对细胞周期蛋白表达的影响。免疫组化方法检测cyclind1在各组的表达情况。结果:(1)体外实验流式细胞术结果显示,相较于正常系膜细胞组(n组),20%fbs促进了系膜细胞由g0/g1期逐渐向s期转变,给药后,g0/g1期的细胞百分比逐渐增加,相应地s期的细胞渐减,该效应具有剂量依赖性;westernblotting结果证明,三氟拉嗪抑制cyclind1,cdk2,cdk4蛋白的表达,促进p21蛋白的表达,而对cycline,cdk6,p27蛋白表达影响不大。(2)体内实验westernblotting结果与体外结果实验一致。进一步,通过免疫组化结果可观察到,狼疮肾组(ln)cyclind1表达较正常小鼠增高,给药tfp后其表达下降,差异有统计学意义。结论:三氟拉嗪可以阻断体外异常增殖的人系膜细胞由g0/g1期进入s期,这可能与它可以抑制cyclind1,cdk2,cdk4蛋白的表达及促进p21蛋白的表达相关。第三部分三氟拉嗪促进系膜细胞的凋亡的研究目的:探讨三氟拉嗪对系膜细胞细胞凋亡的的影响及机制方法:(1)体外实验:流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况,westernblotting,realtimepcr方法分析bcl-2及bax的表达变化。(2)体内实验:动物实验分组情况同第一部分。分别采用westernblotting和免疫组化方法检查各组bcl-2及bax的表达变化。结果:(1)体外实验结果流式细胞术结果显示:与n组(normal组)相比较,con组(control组,20%组)凋亡细胞比例明显偏低。加三氟拉嗪干预24小时后,与con组比较凋亡细胞比率明显增加。realtimepcr结果显示:与n相比较,con组baxmrna的表达量较低,而bcl-2mrna的表达量较高。三氟拉嗪给药干预24小时后,我们可以看到与con组比较,给药组con+tfpbaxmrna的表达量显著增高,而bcl-2mrna的表达量显著降低。westernblotting所监测蛋白水平的变化与基因水平变化相一致。(2)体内实验结果免疫组化方法结果显示:通过镜下棕色颗粒的光密度分析,与n组(normal组)小鼠相比较,ln组(狼疮肾)bax蛋白的表达量较高,而bcl-2蛋白的表达量也增加。三氟拉嗪灌胃给药干预3个月后,bax蛋白的表达量显著升高,而bcl-2蛋白的表达量显著降低。进一步比较三组bax与bcl-2的比值(bax/bcl-2ratio),可以看到ln组较n组低。westernblotting所监测蛋白水平的变化与免疫组化结果相一致。结论:三氟拉嗪可以促进系膜细胞的凋亡,是因为它可以下调bcl-2水平的表达,同时上调bax的表达。第四部分三氟拉嗪通过p-jnk及p-akt通路影响细胞的周期和凋亡目的:进一步研究三氟拉嗪抑制系膜细胞增殖的机制,以及其对信号转导通路p13k/akt,mapk/jnk和mapk/erk1/2的影响。方法:采用westernblotting方法分析tfp对信号转导通路蛋白p-akt/akt,p-erk/erk,p-jnk/jnk表达水平的影响。结果:实验一westernblotting结果表明,与正常细胞对照组(normal)相比,20%fbs组可以增加p-jnk,p-akt,p-erk蛋白的表达。给药tfp后,p-jnk,p-akt的表达下调,这种效应具有剂量依赖性,而各种浓度的tfp对p-erk蛋白蛋白的表达均无影响。实验二westernblotting结果表明,与normal组相比,pdgf刺激后可以增加p-jnk,p-akt,p-erk蛋白的表达。tfp20μm处理后,p-jnk,p-akt的表达下调,但p-erk蛋白的表达变化不明显。结论:三氟拉嗪可能通过抑制jnk/mapk及akt/pi3k通路影响系膜细胞的周期和凋亡,而不影响erk/mapk通路。第五部分三氟拉嗪联合环磷酰胺治疗狼疮性小鼠的实验研究目的:明确与使用单种药相比,三氟拉嗪与环磷酰胺联合使用可以更好地抑制狼疮肾小鼠系膜细胞的增殖,以及观察其对狼疮肾小鼠肝、肾功能的影响。方法:HE、PAS染色后观察各组肾脏系膜细胞增生情况;Western Blotting方法检测各组Ki67和PCNA的表达;ELISA方法检测各组动物血肌酐,尿素氮,谷草转氨酶(AST)水平,比较各组小鼠肾功能的情况。结果:HE和PAS染色实验结果显示,正常小鼠组(N)小鼠肾组织结构正常;狼疮肾组(LN)小鼠有明显系膜细胞增生;狼疮肾+三氟拉嗪组(LN+TFP)、狼疮肾+环磷酰胺组(LN+CTX)较LN组细胞增生有所减轻;狼疮肾+三氟拉嗪+环磷酰胺联合减量用药组(LN+1/2TFP+1/2CTX)与LN组相比,系膜细胞增生程度进一步下降,该实验可从Ki67和PCNA的Western Blotting,免疫组化等结果进一步佐证。ELISA研究结果表明,LN组,LN+TFP组、LN+CTX组、LN+1/2TFP+1/2CTX较N组AST水平上升。与LN组相比,LN+TFP组,LN+1/2TFP+1/2CTX组AST水平无明显差异,而LN+CTX组显著增高。研究还发现,LN+1/2TFP+1/2CTX组较LN+CTX组AST水平显著降低。结论:三氟拉嗪与环磷酰胺联合使用并且剂量减半,可以更好地抑制狼疮肾小鼠系膜细胞的增殖并改善肾功能;三氟拉嗪对肝损伤作用小,与环磷酰胺减半联合使用不良反应更少。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R692

【相似文献】