Akt信号通路通过激活TFEB而抑制氧化应激诱导的神经细胞凋亡

发布时间：2018-03-22 07:36

本文选题：TFEB　切入点：Akt信号通路　出处：《河北医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：机体内氧化系统和抗氧化系统失衡所引起的氧化应激(oxidative stress,OS),可造成细胞内蛋白质、RNA、DNA的损伤。氧化应激过程中产生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)介导脂质过氧化、降低NO生物活性、以及激活炎症基因等一系列病理生理学反应。越来越多的研究表明,氧化应激可以诱发多种疾病,例如神经退行性疾病(neurodegenerative disease)、动脉硬化、以及糖尿病等。在中枢神经系统中,过量的ROS可以导致小胶质细胞活化、神经元以及星形胶质细胞的损伤。帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种中枢系统慢性退行性疾病,其病理特征为多巴胺神经元选择性和渐进性退化以及由氧化应激诱发的神经元凋亡。Akt,又称蛋白激酶B(PKB),是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。该激酶可以调控细胞增殖、细胞迁徙以及细胞凋亡。最近有研究表明,Akt信号通路介导神经元的存活,对PD患者的神经元有保护作用。例如,Akt/Rheb的激活可以使中枢神经系统的轴突再生,并且在PD病人的脑组织中,Akt的表达和磷酸化水平明显降低。对Akt作用机理的研究证实,Akt可以通过磷酸化多种凋亡相关蛋白来抑制细胞凋亡。但Akt信号通路对氧化应激诱导的神经细胞凋亡有何影响目前尚不清楚。TFEB(transcription factor EB),是亮氨酸拉链b HLH-Zip转录因子家族中Mi T/TFE家族中的成员。有文章报道,TFEB参与溶酶体合成和功能的调节,调控细胞自噬,并与神经退行性疾病、癌症、以及溶酶体贮积症等多种疾病相关。最近有报道称,过表达TFEB可以防止MPTP诱导的多巴胺神经元凋亡;TFEB的激活能减轻α-synuclein在脑组织中的异常聚集以及氧化应激和炎症造成的神经细胞的损伤。尽管既往研究已经证实,Akt信号通路和TFEB均参与了细胞存活和细胞凋亡的调节,但是在氧化应激条件下,Akt信号通路和TFEB之间在功能上的联系尚待阐明。本研究旨在探讨Akt信号通路和TFEB之间如何协同拮抗氧化应激诱导的神经元细胞凋亡。第一部分TFEB介导Akt信号通路对过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的抑制作用目的:探讨Akt信号通路对过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的影响,明确Akt信号通路和TFEB在拮抗过氧化氢诱导的神经细胞凋亡中的相互关系。方法:1 MTT实验检测不同浓度的过氧化氢对SH-SHY5Y细胞活力的影响及其与Akt信号通路的关系。2 Western blot检测不同浓度的过氧化氢对Akt磷酸化及其与PARP活化之间的关系。3流式细胞术检测阻断Akt信号通路后过氧化氢对细胞凋亡的影响,以及过表达TFEB阻断或激活Akt信号通路对过氧化氢诱导的细胞凋亡的影响。4免疫共沉淀实验检测TFEB与Akt的结合。结果:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制因Akt信号通路介导生长因子诱导的神经细胞的生存,且过多的ROS损伤神经细胞,所以我们首先检测Akt信号通路是否在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到的影响。用不同浓度的过氧化氢处理SH-SHY5Y细胞,MTT实验结果显示,过氧化氢浓度在100μM和200μM时,SH-SHY5Y细胞活力轻微增加;而过氧化氢浓度在400μM和800μM时,SH-SHY5Y细胞活力显著降低。Western blot结果显示,当SH-SHY5Y细胞给予400μM和800μM的过氧化氢时,Akt磷酸化水平显著降低,说明在过氧化氢诱导SH-SHY5Y细胞凋亡过程中Akt信号通路受到抑制。流式细胞术分析结果显示,当用Akt和PI3K抑制剂wortmannin预处理后,再给予400μM的过氧化氢刺激时,氧化应激诱导的细胞凋亡明显加重。Western blot结果也显示,Akt和PI3K抑制剂可以完全阻断Akt的磷酸化,并且细胞凋亡标志物的剪切即cleaved-PARP显著增加。另外,用持续激活的HA-Akt-CA或它的失活突变体HA-Akt-KD转染SH-SHY5Y细胞后,给予过氧化氢刺激。MTT结果显示,HA-Akt-CA转染的SH-SHY5Y细胞受到过氧化氢刺激后,其凋亡率显著降低。综上所述,这些结果表明,Akt信号通路在氧化应激诱导的神经细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB抑制过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡与Akt信号通路相关因为TFEB抑制细胞凋亡,所以我们进一步检测过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡是否受TFEB的影响。用重组腺病毒Flag-TFEB感染SH-SHY5Y细胞后,用Western blot和流式细胞术检测细胞凋亡。在TFEB过表达的细胞中,过氧化氢引起的PARP的活化受到抑制,并且Akt抑制剂能减少TFEB过表达抑制的PARP的活化。同样,在TFEB过表达的细胞中,再给予Akt信号通路的激活剂EGF时,过氧化氢引起的PARP的活化被取消。我们发现,不管是否给予过氧化氢刺激,在SH-SHY5Y细胞中过表达TFEB均会显著抑制细胞凋亡。为了进一步检测TFEB抑制细胞凋亡是否与Akt信号通路相关,用Akt inhibitor或Akt激活剂EGF预处理细胞后,再给予过氧化氢刺激。流式细胞分析结果显示,过表达TFEB可以显著减少由Akt inhibitor和过氧化氢共同引起的细胞凋亡。相反,Akt信号通路的激活剂EGF减少氧化应激引起的细胞凋亡,过表达TFEB的细胞再给予EGF处理可进一步减少过氧化氢诱导的细胞凋亡。这些结果表明,TFEB抑制氧化应激诱导的细胞凋亡受Akt信号的调节。3 TFEB与Akt存在相互作用上述研究证实,TFEB抑制SH-SHY5Y细胞凋亡受Akt信号通路的调节,我们进一步研究Akt是否可以直接与TFEB相互作用。用野生型的HA-Akt-WT和GST-TFEB转染细胞,GST pull down实验结果显示,HA-Akt可以直接与GST-TFEB结合,但不与GST相互作用。用免疫共沉淀实验检测内源性的Akt是否与TFEB结合,结果显示,在TFEB抗体的免疫沉淀物中检测到Akt蛋白的存在。为了进一步验证TFEB的哪个结构域与Akt结合,用可表达全长TFEB及其不同结构域的表达载体GST-TFEB-FL/GST-TFEB-1-294/GST-TFEB-295-476和HA-Akt-WT共转染HEK293T细胞,通过GST pull down实验检测全长TFEB(TFEB-FL)和各种截短突变体与Akt的结合情况。结果显示,全长TFEB(TFEB-FL)和包含HLH结构域的N端结构域(TFEB-1-294)可以与Akt的结合。当TFEB的N端结构域(TFEB-1-294)被消除时,突变体丧失与Akt的结合。为了进一步检测TFEB与Akt的结合是否受Akt活性的影响,将持续激活型Akt(HA-Akt-CA)/失活型Akt(HA-Akt-KD)/部分失活型Akt(HA-Akt-*KD)和GST-TFEB共转染HEK293T细胞,GST pull down结果显示,TFEB与不同活性形式的Akt均可结合。持续激活型Akt与TFEB结合能力最强,失活型Akt与TFEB的结合最少。为了进一步检测Akt不同结构域与TFEB结合的实验结果显示,TFEB不能与Akt-PH或者Akt-Cat结合,但与Akt-tail具有较强的结合能力。小结:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB通过与Akt相互作用介导过氧化氢对SH-SHY5Y细胞凋亡的影响。第二部分Akt磷酸化TFEB的Ser467位点目的:探讨Akt是否可以磷酸化TFEB以及Akt对TFEB进行磷酸化修饰的位点。方法:1用Akt、PI3K和ERK抑制剂处理细胞,Western blot检测TFEB的磷酸化;在SH-SHY5Y细胞中表达TFEB和TFEB-S467A并给予insulin或Akt inhibitor处理,Western blot检测TFEB-S467位点的磷酸化。2用TFEB截短突变体和不同磷酸化位点突变体转染细胞,Western blot检测Akt抑制剂和激活剂insulin对TFEB-S467磷酸化的影响。3体外Akt活性实验检测TFEB与Akt共孵育后TFEB-S467的磷酸化。结果:1 Akt磷酸化TFEB分别用PI3K抑制剂Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制剂PD98059预处理过表达TFEB的细胞,然后给予insulin刺激,用p-Akt-substrate抗体检测TFEB的磷酸化。Western blot结果显示,给予insulin刺激后,Akt-Ser473的磷酸化水平和Akt底物的磷酸化水平显著升高,PI3K和Akt抑制剂能取消insulin对TFEB和Akt底物磷酸化的诱导,ERK的抑制剂不影响它们的磷酸化。GST pull down实验结果显示,持续活化型的Akt与Akt底物的结合多于野生型Akt和失活型的Akt。用GST-TFEB转染HEK293T细胞后,再分别给予insulin或者Akt inhibitor刺激。结果显示,insulin处理后Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平升高;而Akt inhibitor抑制Akt-Ser473和Akt底物的磷酸化水平。另外,来源于HEK293T细胞中内源性TFEB经Akt激活剂或者抑制剂处理后得到相同的结果。这些结果表明TFEB可以被Akt磷酸化。2 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点构建可表达TFEB不同截短突变体的表达载体转染细胞后,用p-Akt-substrate抗体检测不同截短突变体的磷酸化。结果显示全长TFEB(TFEB-FL)和它的C-端部分(TFEB-320~476,氨基酸320~476)可以被Akt磷酸化,而N-端部分(TFEB-1~319,氨基酸1~319)却不能被Akt磷酸化。说明TFEB-320~476包含Akt磷酸化位点。当TFEB-320~476被进一步截短时,我们发现,TFEB-352~476(氨基酸352~476)可以被Akt磷酸化,提示TFEB被Akt磷酸化的丝氨酸存在于461到476氨基酸之间。进一步把461到476氨基酸之中的丝氨酸都进行点突变。Western blot结果显示,TFEB-S462A和TFEB-S466A以及野生型的TFEB均可以被Akt磷酸化;相反,TFEB-S463/467A和TFEB-S467/469A突变体不能被Akt磷酸化。这些结果表明Ser467是Akt磷酸化TFEB的位点。3 Ser467是Akt磷酸化TFEB的特异性位点为了进一步证实Ser467是Akt磷酸化TFEB的位点,我们制备了特异性的抗TFEB-S467磷酸化抗体,用其检测Akt激活剂或者抑制剂对TFEB-S467磷酸化的影响。免疫沉淀结果显示,给予insulin刺激时,S467A突变体不能被Akt磷酸化,并且不受Akt-Ser473被insulin磷酸化的影响。同样,用Akt inhibitor处理稳定表达Flag-TFEB或TFEB-S467A的细胞株时,TFEB-Ser467和Akt-Ser473的磷酸化都会受到抑制。另外,分别用过Wortmannin、Akt inhibitor和ERK抑制剂PD98059预处理细胞后给予insulin刺激,结果显示,Insulin可以显著增强TFEB-Ser467磷酸化,但在PI3K/Akt抑制剂处理的细胞中不能上调TFEB-Ser467磷酸化水平。体外激酶活性分析也证明突变体TFEB-S467A不能被Akt磷酸化。综上所述,TFEB被Akt磷酸化的位点是Ser467。小结:1 Akt磷酸化TFEB。2 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点。第三部分Akt通过磷酸化TFEB而抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡目的:探讨Akt信号通路抑制过氧化氢诱导的神经细胞凋亡的作用机制。方法:1 Western blot检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对PARP活化的影响。2流式细胞术检测SH-SHY5Y或神经元细胞被重组慢病毒TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D感染后,过氧化氢、Akt抑制剂、EGF对细胞凋亡的影响。3小鼠中脑注射重组腺病毒GFP、TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D后,免疫组化染色观察MPTP对小鼠中脑神经元凋亡的影响。结果:1 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞凋亡首先,我们用野生型的TFEB、TFEB-S467A以及TFEB-S467D(相当于持续活化的TFEB)感染SH-SHY5Y细胞,检查过氧化氢对PARP活化的影响。Western blot结果显示,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著减少过氧化氢诱导的PARP活化,而TFEB-S467A对PARP活化没有影响。为了进一步证实TFEB抑制细胞凋亡依赖于Akt信号通路,用Akt抑制剂或激活剂预处理过表达TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D的SH-SHY5Y细胞后,再给予过氧化氢刺激。Western blot结果显示,过表达TFEB-S467D的细胞与TFEB-S467A细胞相比,过氧化氢或Akt抑制剂引起的PARP活化显著减少;用EGF激活Akt信号通路后,过表达TFEB-S467A的细胞与过表达野生型TFEB和TFEB-S467D的细胞相比,过氧化氢诱导的PARP活化并没有明显减少。另外,流式细胞术结果显示,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著抑制由过氧化氢诱导的细胞凋亡,而S467A突变体失去了这种抑制作用。无论单独给予过氧化氢还是用过氧化氢和Akt inhibitor共同处理细胞,过表达TFEB-S467D均可以减少SH-SHY5Y细胞凋亡。然而用EGF激活Akt后,过表达TFEB-S467A不能抑制过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡。这些结果表明,Akt诱导的TFEB-S467磷酸化是阻抑过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡所必须的。2 Akt诱导的TFEB抑制过氧化氢引起的原代神经元凋亡同时,我们也检测了TFEB-S467磷酸化对过氧化氢诱导的原代神经元凋亡的影响。用TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D感染小鼠原代神经元细胞后,再用Akt inhibitor和过氧化氢处理细胞。Western blot结果显示,过表达TFEB-S467D的细胞与过表达TFEB-S467A的细胞相比,无论单独给予过氧化氢还是用过氧化氢和Akt inhibitor共同处理细胞,PARP的活化均受到显著抑制。与Western blot结果一致,流式细胞术分析结果也显示,过表达TFEB-S467D可以显著抑制由过氧化氢诱导的原代神经元凋亡。这些结果显示,Akt催化的TFEB-Ser467位点磷酸化对阻抑过氧化氢诱导的原代神经元凋亡是必要的。3磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤已经证明,MPTP通过诱导脑组织氧化应激而损伤多巴胺神经元并导致帕金森症。为了进一步探讨TFEB-Ser467磷酸化是否可以保护多巴胺神经元,我们给小鼠中脑注射TFEB、TFEB-S467A、TFEB-S467D腺病毒,使其在脑组织过表达后,观察TFEB-Ser467磷酸化对MPTP诱导的神经元凋亡中的影响。酪氨酸羟化酶的免疫荧光染色结果显示,与未注射的区域相比,过表达TFEB和TFEB-S467D可以显著增加酪氨酸羟化酶阳性神经元细胞的数量,说明细胞存活率增加。这些结果表明,在MPTP诱导的小鼠中脑多巴胺神经元损伤模型中,TFEB-Ser467位点磷酸化可以保护由MPTP诱导的多巴胺神经元损伤。小结:1 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞和原代神经元凋亡。2磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤。结论:1 Akt信号通路在过氧化氢诱导的SH-SHY5Y细胞凋亡中受到抑制。2 TFEB通过与Akt相互作用介导过氧化氢对SH-SHY5Y细胞凋亡的影响。3 Akt磷酸化TFEB的Ser467位点。4 Akt诱导的TFEB磷酸化抑制过氧化氢引起的SH-SHY5Y细胞和原代神经元凋亡。5磷酸化型TFEB可以保护多巴胺神经元免受MPTP的损伤。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R741

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