气滞血瘀证诊断量表及其circRNA差异表达研究
本文选题:证候诊断 切入点:气滞血瘀证 出处:《中国中医科学院》2017年博士论文
【摘要】:中医诊断在历史的变迁过程中所具备的思维丰富性、维度多向性、方法层次性以及模式多样性等独特性及优势性已在临床诊疗疾病中发挥重要的指导作用。但正因为诊断理论内容及体系的多元性、层次性,常使证候诊断的规范及标准化研究一直以来都是中医临床研究的热点与难点。证候诊断的规范,一方面关系到中医临床诊疗水平的提升,另一方面则关系到相关证候类中药新药的研发与使用。具有中医药特色的证候类中药新药的研发标准仍存在争议。究其原因,对于证候的选择及诊断标准的确立是关键点。气血是构成人体的基本物质,也是维持人体生命活动和功能的重要物质。气血关系密切,既可相互维系,也可相互为病,气血病证范围广泛,研发气血相关的证候类中药新药前景广阔。其中,气滞血瘀证是气血病证常见证型,涉及病种广泛,可见于内科、妇科及外科等疾病,是临床常见证候。目前,气滞血瘀证诊断标准及量化研究较少,在一定程度上影响气滞血瘀证的临床疗效。参照现有针对证候诊断研究的方法,开展对气滞血瘀证诊断标准及量化研究,探索其发生发展存在的物质基础,为诊断气滞血瘀证提供依据。方法理论研究:梳理第5版《中华医典》涉及气滞血瘀证相关的古典文献,并对气血、气滞证、血瘀证、气滞血瘀证相关病因病机、主要病症及治法予以列举及论述。分析中国知网1974年1月-2016年9月篇名中明确提到气滞血瘀证的文献,对文献发表时间趋势、文献病种分布情况及文献研究类型及趋势进行分析。临床研究:设计半开放式问卷,针对参加“2015年中华中医药学会心血管病分会学术年会”的包括副高级及以上职称医师及研究者进行问卷调查,了解气滞血瘀证诊断标准形成的形式及内容,确立气滞血瘀证条目池,并以此条目池设计半封闭型《气滞血瘀证患者临床调查表》。开展临床横断面研究,于2016年4月至2016年11月期间在中国中医科学院广安门医院收集住院及门诊病例。研究前明确研究人员资质、调查对象的纳入及排除标准,规范调查问卷填写的方式。研究过程中采集患者年龄、性别、出身地、病程等一般情况、生活习惯、症状与体征、疼痛性质、血常规及凝血四项实验室指标。临床数据采用频数分析、相关性分析、聚类分析、主成分分析、因子分析、区分度、相关系数、logistic回归等方法进行分析,运用ROC曲线及约登指数对量表进行界值的确定及模型的构建。运用敏感度、特异度、判断准确率等指标对形成量表的性能进行评价。实验研究:采集实验对象25例,分为冠心病气滞血瘀证组、冠心病非气滞血瘀证组、慢性胃炎气滞血瘀证组、类风湿关节炎气滞血瘀证组及健康对照组各5例,征得其同意后,采集年龄、性别、身高、体重、血压、既往病史等。抽取外周血,运用红细胞裂解液,分离白细胞,提取总RNA,并采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分析测定总RNA的纯度、浓度及完整性。运用NanoDrop及Agilent 2100生物分析仪对总RNA的质量进行检测。采用高通量测序,并通过碱基质量分布、GC含量分布、测序饱和度分析、测序随机性评估、reads在不同元件的富集分析、基因覆盖度分析、reads在参考基因组上的分布等7方面对circRNA测序质量进行评估。与circBase数据进行比对,对测序结果予以鉴定,可得到己知circRNA及预测circRNA,利用CIRI软件进行统计,并根据circRNA染色体的位置对circRNA来源基因进行注释。用RPM对circRNA进行定量分析,样品间相关性检验及主成分分析、聚类分析对circRNA组间关系进行分析,负二项分布原理进行差异表达分析,并对差异表达的circRNA来源基因进行KEGG富集分析。结果理论研究:参考101部古典文献,气滞血瘀证的发生可因外伤、情志不遂、寒邪、过于安逸、房室不当、误食药物或失治以及产后失调等因素引起,其中外伤、情志不遂、寒邪多见;气滞血瘀证以各种痛症最为常见,可见胸痛、胃痛、腹痛、关节疼痛等,也可见症瘕、积聚、五瘤等肿块或包块,其具有气滞证和血瘀证所表现的症状;纳入分析的1121篇气滞血瘀现代文献中,共有841篇与疾病有关,主要涉及76种病种,并主要集中在妇科、外科/骨科、心血管疾病及消化疾病等;气滞血瘀证相关证候诊断标准研究内容较少,开展气滞血瘀证诊断标准及量化研究具有现实意义。临床研究:1专家咨询:45位专家,男性29例,女性16例,平均年龄48.67岁,博士占49%,硕士占29%,本科占22%。共有29名专家参加过诊断规范研究,占64.44%。综合专家意见,确立气滞血瘀证患者临床调查表中的条目池42个。2临床横断面研究2.1一般情况:共收集1076例临床病例,其中气滞血瘀证667例,非气滞血瘀证409例,男性467人,占43.40%,女性609人,占56.60%,年龄最大89岁,最小18岁,平均年龄为57.44岁;出身地共涉及21个省及直辖市,其中以华北地区为主,北京市(751例)、河北省(94例)、内蒙古自治区(32例);病程最短为0.1年,病程最长57年,平均病程6.6年;共涉及种西医疾病115种,中医疾病主要涉及57种。1076例患者中,共包括147个症状,其中频次较高的症状有疼痛(871次)、性情急躁易怒(671次)、头晕(419次)等;共涉及舌象20个,其中暗红(476次)、薄白(399)次、薄白腻(210次)等;共涉及脉象12个,其中脉细(414次)、弦(290次)、沉(187次)、涩(149次)等;1076例患者中,近一月内病情与情绪有关(732例)、日常参加体力活动(每周2次,每次30分钟)(451例)、日常有久坐或久卧习惯(除正常睡眠外,每周3次,每次1小时)(744例)等;有871位患者有疼痛症状,其中疼痛固定(648例)、胀痛(532例)、刺痛(264例)。2.2气滞血瘀证诊断相关元素的相关性分析:情绪因素(P=0.000)、饮酒(P=0.46)、胀痛(P=0.001)、窜痛(P=0.027)、刀割样疼痛(P=0.035)、PLT(P=0.042)、PT(P=0.042)、INR(P=0.024)与气滞血瘀证存在正相关性;钝痛(P=0.028)、RBC(P=0.014)、HBG(P=0.008)、HCT(P=0.008)与气滞血瘀证存在负相关性。2.3条目池的归类与降维:症状聚类分析可分为4类,其中典型代表的为疼痛、性情急躁易怒;因子及主成分分析可分为9类因子,根据变量特点,可将疼痛、性情急躁易怒、痛经、月经色暗、腹痛、胸闷、胸痛、胃痛、尿痛等视为气滞血瘀证的潜在因素;脉象聚类可分为3类,其中典型代表为脉沉、脉涩;因子及主成分分析可分为3类因子,其中脉沉、脉涩可视为气滞血瘀证的潜在因素;舌象:舌象聚类可分为3类,舌紫暗、舌上瘀点或瘀斑以及舌淡紫为一类;对667例气滞血瘀证患者的舌象进行因子及主成分分析,其中舌紫暗被视为气滞血瘀证的潜在因素;2.4条目池的筛选:在对条目的筛选时,参照专家意见、相关系数以及区分度,结合古典文献以及新药指导原则,对进入logistic逐步回归模型构建的条目进行判断,待选条目须满足以上五方面中的两方面即可进入模型构建。满足的条目有44个,考虑本次研究的目的是为了探讨能够具有一定普适性使用的气滞血瘀证诊断量表,将妇科代表性的行经伴血块、月经色暗条目排除,并将腰痛、胃痛、腹痛、肢体疼痛、头痛、痛经、背痛、关节疼痛以及乳房胀痛具有疼痛的性质合并为疼痛一个条目,将性情急躁易怒与情绪抑郁合并为情志不遂一个条目。最终进入logistic逐步回归模型构建的条目有33个,包括:疼痛、情志不遂、疼痛固定、胀痛、刺痛、窜痛、刀割样痛、钝痛、局部活动受限、肿块或包块、暧气、反酸、烧心、乏力、多饮、腹胀、口干、胸闷、胸胁胀闷、尿频、肌肤甲错、面色黧黑、爪甲青紫、肌肤瘀斑瘀点、口唇紫暗、舌上瘀斑或瘀点、舌质紫暗、舌质暗红、脉涩、脉弦、脉沉、脉细、脉紧。2.5赋权与界值的确定:运用logistic逐步回归,对进入模型的33个条目进行向后条件逐步回归分析,一共回归15步,其中,第3步预测总计百分比为81.5%,H-LP=0.1050.05,被认为是回归步骤中最适合构建模型。其中P0.05的条目有疼痛(P=0.000)、情志不遂(P=0.000)、肿块或包块(P=0.001)、舌质紫暗(P=0.039)、乏力(P=0.023)、局部活动受限(P=0.035)、口唇紫暗(P=0.024)、舌上瘀点或瘀斑(P=0.002)、脉沉(P=0.011),共9个条目被认为是对模型具有统计学意义的条目,而乏力、活动受限、口唇紫暗所得系数为负值,不适合作为诊断量表的条目,故以排除,得到疼痛、情志不遂、肿块或包块、舌质紫暗、舌上瘀点或瘀斑、脉沉6个条目。在此基础上,将胀痛、窜痛、胸闷、脉涩4个条目纳入模型的构建,最终得到的10个条目再次运用二元logistic回归进行模型的构建。使用该模型诊断所产生的数据与医生判断的数据绘制气滞血瘀证的ROC曲线,其ROC曲线下的面积为0.851。该模型的约登指数值为0.63,相应的敏感度为79.9%,特异度为83.1%。依据界值以及logistic回归形成的模型,可理解为Y=1.555×疼痛+2.637×情志不遂+0.330 X胀痛+1.081 X窜痛+0.051×胸闷+1.257×肿块或包块+0.700×舌上瘀斑或瘀点+0.207×舌质紫暗+0.630×脉涩+0.318×脉沉3.356时,气滞血瘀证诊断成立。2.6量表构建与性能评价:该气滞血瘀证诊断量表理论上最高诊断分数为51.5分,诊断分数达到20分即可诊断气滞血瘀证,其敏感度为80.35%,特异度为81.91%,判断准确率为80.94%,结果达到预期目标。实验研究:对25例实验对象进行组间基线比较,其中,性别(P=0.42)、糖尿病(P=0.114)、癌症(P=0.384)、体重(P=0.324)、舒张压(P=0.469)、收缩压(P=0.14)P0.05,组间无明显差异,高血压(P=0.017)、年龄(P=0.008),P0.05,组间存在一定差异;本次实验所提取的总RNA,RIN在8.6~10.0之间且28S/18S在1.1~1.8之间,结果提示所提取的总RNA满足实验要求,并且测序结果质量较好,所产生的circRNA数据的准确性对后续鉴定、注释与定量的可靠性奠定了基础。25个样本共测到28059个circRNA,其中,长度≥200bp的有26578个,≥500bp的有14107个,≥1000bp的有6843个,总长度66844321bp,平均长度为2382.2bp;28059个circRNA,其中10955个是在circBase,而另外的 17104 个是预测的 circRNA。sense-overlapping circRNA 共有 24632 个,占87.79%,exonic circRNA共有1217个,占4.34%,各分组组内的样本相似度较低。共找到气滞血瘀证circRNA差异表达的有4个,分别是circRNA_09849、circRNA_11523、circRNA_18046、circRNA_24450,其中 circRNA_11523 可与己知的circBase中hsa_circ_0005860相关,其余三个为预测的circRNA。对气滞血瘀证的差异circRNA进行KEGG富集分析,最终一共找到5个富集通路,包括path:hsa05144,path:hsa04914,path:hsa04650,path:hsa04110 以及 path:hsa05203,并参与了 Natural killer cell mediated cytotoxicity 通路及 Cell cycle 通路的调控作用。结论气滞血瘀证是临床常见证候,涉及病种广泛,其病因病机以外伤、情志不遂及寒邪多见,其表现出的病证复杂多样,以各种痛症最为常见,对其进行主次症及量化研究具有现实意义;形成具有一定普适性的气滞血瘀证诊断量表,可为临床诊断气滞血瘀证提供依据;气滞血瘀证存在差异表达的circRNA,需进一步qPCR验证。
[Abstract]:......
【学位授予单位】:中国中医科学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R241
【参考文献】
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,本文编号:1659469
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