IL-6和sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化和活性的差异性调节及其机制研究

发布时间：2018-03-24 18:01

  本文选题：IL-6　切入点：sIL-6R　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：背景和目的:牙周炎是口腔临床中的常见病和多发病,是导致中老年人牙齿缺失的主要原因。菌斑生物膜是牙周炎发展的启动因素,牙周致病菌及其代谢产物在局部牙周组织积聚,.募集大量免疫细胞,引发炎症和牙周支持组织(牙周韧带、牙骨质和牙槽骨)破坏,造成牙周袋形成和牙槽骨吸收,最终导致牙齿松动和脱落。在牙周病的发展过程中,显著而持续的炎症微环境对牙槽骨的侵蚀破坏起着重要作用。由牙周致病菌刺激募集而来的单核-巨噬细胞和淋巴细胞产生的IL-6、TNF-α IL-1等炎症因子能够直接或间接地招募破骨细胞前体细胞并促使其分化为成熟的破骨细胞,引起牙槽骨吸收破坏。IL-6是由活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子,在体内和体外都具有很强的促进破骨细胞分化的作用。临床调查发现,牙周炎患者局部牙周组织及龈沟液中IL-6水平明显高于健康人群,经过牙周基础/序列治疗后IL-6水平显著降低,提示IL-6与牙周组织炎症和牙槽骨吸收密切相关。以往研究认为IL-6促进骨吸收的作用是通过成骨细胞/间充质细胞介导的,即IL-6促使以上两类细胞分泌破骨诱导因子RANKL,进而诱导破骨细胞前体细胞的分化成熟,而IL-6对破骨细胞前体细胞分化本身无影响。然而近年来有研究表明IL-6也能够通过破骨细胞前体细胞表面的IL-6R直接调节RANKL诱导的破骨细胞分化,并且这个作用不是促进而是抑制。对于以上研究的矛盾结果,目前学术界还没有合理的解释。sIL-6R是IL-6R的可溶性形式,与膜结合型IL-6R类似,也能够与IL-6结合诱导gp-130的二聚化,从而激活IL-6信号转导,是经典IL-6-IL-6R系统的有力补充。研究发现在很多情况下,只有在sIL-6R存在的情况下IL-6才能充分发挥其生理学作用。比如在没有RANKL的情况下,IL-6与sIL-6R联用能够诱导少量纯化破骨细胞前体细胞的破骨向分化,而单独使用IL-6则不能产生类似作用。因此,我们推测sIL-6R是IL-6信号转导的必要补充,在研究IL-6与破骨细胞分化关系的时候有必要将sIL-6R的作用考虑其中。综上,为了探究IL-6调节RANKL诱导的破骨细胞分化的确切机制,我们分别建立了两种破骨细胞前体细胞(小鼠骨髓单核细胞BMMs和小鼠单核细胞系RAW264.7细胞)的体外诱导分化模型,以足量IL-6/sIL-6干预不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化,观察IL-6/sIL-6对体外破骨细胞诱导分化的影响。同时沿RANK信号转导路径,检测RANK下游与破骨细胞分化相关的信号通路的激活情况,初步探讨IL-6/sIL-6对RANKL介导的破骨细胞分化的调控机制,以期更深入地理解炎症性骨吸收的病理发生以及炎症因子对破骨细胞分化的调节,为临床研发新的更有效的牙周炎治疗方法开辟一条新的思路。材料与方法:1.体外破骨细胞诱导分化模型的建立。分离培养小鼠骨髓单核细胞BMMs,购买小鼠单核细胞系RAW264.7细胞并传代培养,细胞生长状态良好后在培养基中加入30 ng/ml M-CSF和梯度浓度RANKL进行破骨细胞诱导培养,隔天更换培养基。诱导培养4天后行TRAP染色观察多核破骨样细胞的生成情况。为检测破骨细胞骨吸收能力,将细胞接种于破骨细胞功能检测板中,破骨诱导培养7天后观察并统计破骨细胞吸收陷窝面积。2.IL-6/sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化和活性影响的研究。在不加RANKL的情况下,以不同浓度IL-6、sIL-6R或IL-6+sIL-6R处理BMMs细胞,4天后TRAP染色观察破骨样细胞的生成情况。在加入梯度浓度RANKL的情况下,以不同浓度IL-6、sIL-6R或IL-6+sIL-6R处理BMMs细胞,4天后TRAP染色观察破骨样细胞的生成情况。破骨细胞功能实验检测破骨细胞的骨吸收能力;实时定量PCR检测破骨细胞标志性基因TRAP、CK、CTR、MMP-9 mRNA的表达;Western blot检测破骨细胞生成相关转录因子NFATc1及c-fos的表达。3.IL-6/sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化和活性的差异性调节的机制研究。以足量IL-6/sIL-6R分别干预10 ng/ml和50 ng/ml RANKL诱导的BMMs破骨细胞分化体系,在0、2、4天收集细胞,Western blot检测TRAF6蛋白的表达;以 100 ng/ml IL-6/sIL-6R 预处理 BMMs 细胞,然后分别以 10 ng/ml 和 50 ng/ml RANKL进行诱导,在0、5、15、30分钟时收集细胞,用免疫共沉淀法检测RANK与TRAF6蛋白的结合情况;以100 ng/ml IL-6/sIL-6R预处理BMMs细胞,然后分别以10 ng/ml和50 ng/ml RANKL进行诱导,在0、15、30、60分钟时收集细胞,Western blot 检测 p-p-38、p38;p-ERK、ERK;p-JNK、JNK;p-Akt、Akt;p-NF-κB、NF-κB的蛋白表达水平。结果:1.体外破骨细胞诱导分化模型的建立。BMMs和RAW264.7细胞都能在RANKL的诱导下分化为TRAP染色阳性的多核巨细胞且具有在破骨细胞功能检测板上形成吸收陷窝的能力。BMMs和RAW264.7细胞分化形成的破骨细胞在形态、大小和骨吸收能力方面有差别。由以上两种细胞诱导形成的破骨细胞数量、大小和骨吸收能力与所使用RANKL的浓度呈剂量相关性,50 ng/ml为RANKL诱导破骨细胞分化的饱和浓度。2.IL-6/sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化和活性影响的研究。单独应用IL-6或sIL-6R都不能诱导TRAP染色阳性的破骨样细胞生成,IL-6与sIL-6R联用能够诱导少量的、体积较小的破骨样细胞生成。sIL-6R对RANKL诱导的破骨细胞形成无影响;IL-6抑制高浓度RANKL诱导的破骨细胞形成;IL-6/sIL-6R能够促进低浓度(10ng/ml)RANKL诱导的破骨细胞生成而抑制高浓度(50ng/ml)RANKL诱导的破骨细胞生成。进一步实验证明IL-6/sIL-6R对不同浓度的RANKL诱导的破骨细胞分化的差异性调节还体现在骨吸收活性、破骨细胞分化标志基因(CTR、CK、MMP-9和TRAP)和关键转录因子(NFATcl和c-fos)表达上,与TRAP染色结果一致。3.IL-6/sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化和活性的差异性调节的机制研究。Western blot结果显示IL-6/sIL-6R不改变RANKL刺激下破骨细胞前体细胞TRAF6蛋白的表达;免疫共沉淀结果显示高/低浓度RANKL诱导的RANK-TRAF6结合也不受IL-6/sIL-6R预处理的影响。信号通路研究表明IL-6/sIL-6R分别促进/抑制了低/高浓度RANKL诱导的NF-κB、ERK和JNK信号通路的激活,但是对p-38、Akt信号通路无明显影响。结论:1.分离培养小鼠骨髓单核细胞BMMs和小鼠单核细胞RAW264.7细胞系,用M-CSF和不同浓度RANKL进行破骨分化诱导,并进行了初步的破骨细胞形态及功能鉴定,成功建立了体外破骨细胞诱导分化模型。2.IL-6/sIL-6R促进了低浓度(10 ng/ml)RANKL诱导的破骨细胞分化,而对高浓度(50 ng/ml)RANKL诱导的破骨细胞分化表现为抑制作用。3.IL-6/sIL-6R对不同浓度RANKL诱导的破骨细胞分化的差异性调节发生在TRAF6的下游,可能是通过IL-6-IL-6R-gp130信号转导调节RANKL介导的NF-κB、ERK和JNK信号通路的激活实现的。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R781.4

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本文编号：1659410