Annexin A2对卵巢癌生物学行为的影响及机制研究

发布时间：2018-03-27 12:19

本文选题：Annexin　切入点：A2　出处：《郑州大学》2017年博士论文

【摘要】：统计数据显示在美国女性中因肿瘤所致死亡病因中卵巢癌排名第五位,同时也是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。预计在2017年美国新发卵巢癌病例数量为22,440例,死亡数量为14,080例。卵巢癌致死率高的主要的原因在于70%的患者在患病最初就发生了腹腔转移。在过去的20年,以紫杉醇、铂类为基础的化疗,腹腔灌注化疗、靶向药物新型单抗如贝伐单抗等的应用提高了早期患者的总生存率。但是卵巢癌患者总体存活率仍然较低,对卵巢癌的侵袭转移、肿瘤复发、化疗耐药等的分子机制进行深入研究,探索新的治疗方向,就显得尤为重要和迫切。上皮-间质转化(EMT)指有极性、静止的上皮细胞转化为运动的间质细胞的生理过程,最初对该现象的认识始于胚胎发育几个关键阶段的研究,近来EMT在肿瘤的侵袭和转移中发挥的作用也日渐得到研究者的关注。Annexin A2作为一种表达于多种细胞类型上的钙依赖性磷酸化蛋白,在多种肿瘤细胞上表达上调,调控多种细胞功能,包括细胞增殖和凋亡,细胞粘附、侵袭和迁移,血管生成等。Annexin A2激活纤溶系统,起到重构细胞骨架和重塑肌动蛋白的调控作用,在肿瘤的侵袭和转移中有着非常重要的促进作用。最近的研究发现在卵巢癌细胞及腹膜细胞共培养的培养基中Annexin A2和纤溶酶表达上调,提示其作为肿瘤-宿主信号通路的一部分,参与促进卵巢癌细胞的转移。越来越多的证据表明Annexin A2和其结合蛋白的相互作用在肿瘤微环境中也起到重要作用,共同增强了肿瘤转移的能力。最近的研究显示Annexin A2可能和卵巢癌的EMT相关,促进肿瘤的进展,但具体分子机制不明。深入研究Annexin A2在卵巢癌中的作用及分子机制,对于指导卵巢癌的诊断及治疗有着重要的意义。本研究应用免疫组织化学染色技术检测正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤以及上皮性卵巢癌中Annexin A2,β-catenin,E-cadherin和N-cadherin的蛋白表达情况,统计四者蛋白表达趋势,分析四者表达与上皮性卵巢癌患者临床病理特征之间的关系,并进一步分析在卵巢癌病例中四者表达彼此相关性。而后检测人卵巢癌细胞株(SKOV3和UACC-1598)与人卵巢上皮细胞株(HOSEpi C)中Annexin A2的m RNA及蛋白表达情况,下调Annexin A2表达后,应用MTT、Brd U、transwell技术检测Annexin A2对SKOV3和UACC-1598细胞增殖、侵袭能力的影响,对细胞上皮标记物(E-cadherin)及间皮标记物(N-cadherin)的影响,并且进一步探讨β-catenin在介导Annexin A2促进卵巢癌细胞增殖及上皮间质转化中的重要作用,研究Annexin A2在卵巢癌中的作用及其分子机制。第一部分:Annexin A2,β-catenin,E-cadherin,N-cadherin在卵巢癌组织中的表达及与临床病理间关系的研究目的通过检测Annexin A2,β-catenin,与上皮细胞标记物E-cadherin,间皮细胞标记物N-cadherin在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、上皮性卵巢癌组织中的表达水平及趋势,探讨Annexin A2,β-catenin,E-cadherin,N-cadherin蛋白与卵巢病变临床病理及分期之间的关系。方法1.采用免疫组织化学的方法检测30例正常卵巢上皮组织、35例良性卵巢肿瘤组织、40例上皮性卵巢癌组织中Annexin A2、β-catenin、E-cadherin及N-cadherin蛋白表达情况。2.分析四项指标表达趋势,其和上皮性卵巢癌临床病理参数之间的关系以及四者彼此之间的相关性。统计学方法数据统计处理采用SPSS21.0统计分析软件进行。计量资料以sx±表示,组间比较采用方差分析;计数资料比较用c2检验,以α=0.05作为检验水准,以p0.05作为显著性差异的标准,两变量间的相关性检验采用Spearman相关分析法。结果1.免疫组化结果显示,Annexin A2蛋白在三种卵巢组织的细胞膜上均有表达,但在上皮性卵巢癌组织中的表达强度明显增高,阳性表达率显著高于良性肿瘤组及正常组(p0.05)。Annexin A2蛋白在上皮性卵巢癌中表达阳性率与病理分型无显著相关性(p0.05),与肿瘤组织分化、临床分期及淋巴结转移呈显著正相关(p0.05)。2.β-catenin蛋白在三种卵巢组织的细胞膜上均见表达,但在正常组及良性肿瘤组表达主要定位在细胞膜,在卵巢癌组织中出现细胞核和细胞质的异位表达增多。在上皮性卵巢癌中β-catenin蛋白的阳性表达率明显高于良性组及正常组(p0.05),且与肿瘤的病理分型、组织分化均无显著相关性(p0.05)。β-catenin蛋白的表达水平与临床分期、淋巴结转移呈显著正相关(p0.05)。3.E-cadherin蛋白在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌的细胞膜上均有表达,但在正常组及良性组中的表达强度明显高于恶性组。E-cadherin蛋白在细胞膜上阳性细胞百分率70%判为阳性,其表达阳性率在上皮性卵巢癌组织中显著升高(p0.05),与肿瘤的病理分型、组织分化均无显著相关性(p0.05)。E-cadherin蛋白表达阳性率与卵巢癌的临床分期、淋巴结转移呈显著性相关(p0.05),即随着分期升高,肿瘤的淋巴结转移,E-cadherin蛋白在细胞膜上的表达下降。4.N-cadherin蛋白主要表现为在间质细胞的胞膜上出现棕黄色颗粒,在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤中均未发现其表达。N-cadherin蛋白的表达阳性率在上皮性卵巢癌组织中明显高于正常组及良性组(p0.05),且与肿瘤的临床分期、淋巴结转移呈显著正相关(p0.05)。5.在上皮性卵巢癌组织中Annexin A2与β-Catenin、E-cadherin的表达显著正相关(p0.05),与N-cadherin的表达无显著相关。β-Catenin与E-cadherin的表达显著相关(p0.01),与N-cadherin表达无显著相关。E-cadherin与N-cadherin的表达无明显相关性。结论1.与正常卵巢组织,良性卵巢肿瘤组织相比,Annexin A2,β-catenin,E-cadherin,N-cadherin在上皮性卵巢癌中的阳性表达率升高,有显著性差异。2.Annexin A2,β-catenin,E-cadherin,N-cadherin在上皮性卵巢癌中的阳性表达率与肿瘤的临床分期、淋巴结转移有关。3.Annexin A2,β-Catenin与上皮性卵巢癌的EMT现象相关,可能在卵巢癌侵袭转移中发挥重要作用。第二部分:Annexin A2对卵巢癌细胞生物学行为的影响及其作用机制的研究目的本研究旨在体外实验中探讨Annexin A2对上皮性卵巢癌细胞株生物学行为的影响,以及β-catenin在Annexin A2发挥功能中扮演的角色,为上皮性卵巢癌的分子靶向治疗提供新的实验数据和理论依据。方法1.采用Western Blot方法分别检测人上皮性卵巢癌细胞株(SKOV3和UACC-1598)和正常人卵巢上皮细胞株HOSEpi C中Annexin A2的蛋白表达;2.根据文献合成Annexin A2 si RNA并转染入卵巢癌细胞株SKOV3和UACC-1598,通过RT-PCR和Western Blot方法,检测Annexin A2 si RNA对卵巢癌细胞株SKOV3和UACC-1598中Annexin A2 m RNA及蛋白水平的抑制效应;应用Brd U,MTT实验方法检测抑制Annexin A2表达对卵巢癌细胞增殖能力的影响;通过transwell实验检测抑制Annexin A2表达对卵巢癌细胞侵袭能力的影响;通过Western Blot检测抑制Annexin A2表达对卵巢癌细胞上皮间质转化中分子标记物(E-cadherin和N-cadherin)的影响;通过Western Blot检测转染Annexin A2 si RNA两株细胞系SKOV3、UACC-1598中总β-catenin及细胞核内β-catenin的蛋白表达变化;3.成功构建β-catenin的真核表达质粒载体,并命名为pc DNA3.1-β-catenin;与Annexin A2 si RNA共转染人卵巢癌细胞系SKOV3、UACC-1598,检测下调Annexin A2同时上调β-catenin对卵巢癌细胞增殖、侵袭及EMT的影响。统计学方法数据处理应用统计分析软件SPSS21.0进行,数据符合正态分布的采用;数据不符合正态分布的则经处理后使之服从正态分布;对多组间数据行单因素方差分析(包括LSD检验及Bonferroni检验);以α=0.05作为检验水准,以p0.05作为显著性差异的标准。结果1.细胞株SKOV3、UACC-1598和HOSEpi C中Annexin A2的蛋白表达Annexin A2在三株细胞中均有表达,但在卵巢癌细胞株SKOV3、UACC-1598中的表达显著高于正常卵巢上皮细胞株HOSEpi C中的表达。在三株细胞系中的表达量分别为2.73±0.17,3.22±0.25,0.96±0.13,细胞株SKOV3、UACC-1598中Annexin A2的表达与HOSEpi C中Annexin A2的表达相比有显著性差异(p0.01)。2.Annexin A2 si RNA转染卵巢癌细胞株SKOV3、UACC-1598后Annexin A2 m RNA的表达情况收集Annexin A2 si RNA转染48小时后的卵巢癌细胞,检测细胞中Annexin A2 m RNA被抑制的水平。未转染、转染无意义si RNA和Annexin A2 si RNA分别被定义为空白组、对照组和实验组。与空白组及对照组相比,实验组Annexin A2 m RNA水平显著下调,与前两者相比,具有显著性差异(p0.01)。SKOV3细胞实验组、对照组、空白组中Annexin A2 m RNA表达相对量分别为1.22±0.02,3.53±0.16,3.37±0.53;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中Annexin A2m RNA表达相对量分别为1.08±0.05,3.16±0.28,3.09±0.73。3.Annexin A2 si RNA转染卵巢癌细胞株SKOV3、UACC-1598后Annexin A2蛋白的表达情况收集Annexin A2 si RNA转染48小时后的卵巢癌细胞,检测细胞中Annexin A2蛋白被抑制的效果。与空白细胞组及阴性对照组相比,实验组Annexin A2蛋白水平显著下调,与前两者相比,具有显著性差异(p0.01)。SKOV3细胞实验组、对照组、空白组中Annexin A2蛋白表达相对量分别为0.93±0.05,3.36±0.18,3.14±0.16;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中Annexin A2蛋白表达相对量分别为1.32±0.15,3.42±0.53,3.56±0.22。4.转染Annexin A2 si RNA后SKOV3、UACC-1598细胞增殖情况使用BrdU方法SKOV3细胞实验组、对照组、空白组吸光度分别为0.53±0.08,0.79±0.02,0.82±0.03;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中吸光度分别为0.42±0.01,0.88±0.06,0.91±0.06。使用MTT方法SKOV3细胞实验组、对照组、空白组吸光度分别为0.37±0.08,0.69±0.16,0.75±0.12;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中吸光度分别为0.42±0.06,0.77±0.15,0.83±0.13。与空白组及阴性组相比,转染Annexin A2 si RNA后,SKOV3、UACC-1598细胞的增殖能力显著降低(p0.05)。5.转染Annexin A2 si RNA后SKOV3、UACC-1598细胞侵袭情况变化使用Transwell计数SKOV3实验组、对照组、空白组侵袭细胞的数目分别为46±12,88±9,93±16;UACC-1598实验组、对照组、空白组侵袭细胞的数目分别为58±5,85±12,89±10。与空白细胞组及阴性对照组相比,实验组侵袭细胞数明显减少,细胞的侵袭能力明显下降,统计具有显著性差异(p0.05)。6.转染Annexin A2 si RNA后SKOV3、UACC-1598细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平的变化Annexin A2 si RNA转染SKOV3细胞后E-cadherin、N-cadherin蛋白在实验组、对照组、空白组表达的相对量分别为4.37±0.88,2.19±0.07,2.08±0.75;1.97±0.39,4.07±0.93,3.96±0.83。Annexin A2 si RNA转染UACC-1598细胞后E-cadherin、N-cadherin蛋白在实验组、对照组、空白组表达的相对量分别为3.59±0.88,2.38±0.77,2.43±0.53;1.99±0.21,3.98±0.85,4.35±1.10。与空白细胞组及阴性对照组相比,实验组细胞E-cadherin表达显著上调、N-cadherin表达明显下调,提示肿瘤细胞上皮间质转化受到抑制(p0.05)。7.转染Annexin A2 si RNA后SKOV3、UACC-1598细胞中β-catenin表达变化收集Annexin A2 si RNA转染48小时后的卵巢癌细胞,使用RT-PCR及western blot分别检测β-catenin m RNA及蛋白被抑制的效果。与空白细胞组及阴性对照组相比,实验组β-catenin m RNA及蛋白水平显著下调,与前两者相比,具有显著性差异。SKOV3细胞实验组、对照组、空白组中β-catenin蛋白及mRNA相对表达量分别为1.47±0.36,3.83±0.56,3.96±0.83;1.63±0.11,3.99±0.12,4.29±0.25。UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中β-catenin蛋白及m RNA相对表达量分别为2.05±0.12,3.95±0.52,3.88±0.82;2.05±0.12,3.95±0.52,3.88±0.82(p0.05)。8.转染Annexin A2 si RNA后SKOV3、UACC-1598细胞中核内β-catenin表达变化收集Annexin A2 si RNA转染48小时后的卵巢癌细胞,抽提细胞核蛋白,检测细胞核内β-catenin蛋白被抑制的效果。与空白组及阴性组相比,实验组核内β-catenin蛋白水平显著下调,与前两者相比,具有显著性差异(p0.01)。SKOV3细胞实验组、对照组、空白组中β-catenin蛋白表达量分别为0.37±0.02,1.6±0.03,1.8±0.03;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中β-catenin蛋白表达量分别为0.63±0.06,1.5±0.14,1.2±0.07。9.成功构建真核表达载体pc DNA.3.1-β-catenin试验分组分别命名为Annexin A2 si RNA、non-special si RNA、Annexin A2si RNA-β-catenin,Annexin A2 si RNA-pc DNA.3.1,采用Western Blot的方法检测Annexin A2和β-catenin的表达。结果显示Annexin A2 si RNA-β-catenin组与non-special si RNA比较Annexin A2表达显著下调,与Annexin A2si RNA-pc DNA.3.1比较β-catenin显著上调,差异具有统计学意义(p0.05),证明共转染有效下调Annexin A2,上调β-catenin,可以用于后续试验。10.下调Annexin A2同时上调β-catenin卵巢癌细胞增殖能力的变化Annexin A2 si RNA-β-catenin,Annexin A2 si RNA-pc DNA.3.1,Annexin A2si RNA分别称为实验组、对照组、空白组,应用MTT方法检测细胞增殖能力变化,SKOV3三组的吸光度分别为0.67±0.12,0.21±0.06,0.25±0.03;UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组中吸光度分别为0.72±0.10,0.28±0.08,0.3±0.07。较之空白组及对照组,上调β-catenin后显著恢复了受抑制的卵巢癌细胞的增殖力(p0.01)。11.下调Annexin A2同时上调β-catenin卵巢癌细胞侵袭情况变化计数SKOV3实验组、对照组、空白组Transwell试验下层侵袭细胞的数目分别为85±26,49±12,51±15;UACC-1598实验组、对照组、空白组细胞数目分别为91±13,50±18,45±9。与空白组及阴性组相比,实验组侵袭细胞数增多,受抑制的细胞侵袭能力明显恢复,统计具有显著性差异(p0.01)。12.下调Annexin A2同时上调β-catenin对卵巢癌细胞中E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平的变化SKOV3细胞实验组、对照组、空白组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的相对量分别为2.42±0.25,3.95±0.15,4.32±0.06;4.04±0.27,1.987±0.32,2.02±0.16。UACC-1598细胞实验组、对照组、空白组E-cadherin、N-cadherin蛋白表达的相对量分别为2.05±0.15,4.42±0.37,4.02±0.51;3.89±0.44,2.01±0.22,2.43±0.29。与空白组及对照组相比,实验组细胞E-cadherin表达显著下调、N-cadherin表达明显上调,提示逆转了原有受抑制的肿瘤细胞的上皮间质转化过程。结论:1.Annexin A2在卵巢癌细胞的增殖、侵袭、EMT过程中发挥作用。2.抑制Annexin A2基因表达可显著抑制卵巢癌细胞的增殖、侵袭能力,并抑制卵巢癌细胞的上皮间质转化进程。3.下调Annexin A2降低了细胞总体及核内的β-catenin表达。4.下调Annexin A2同时上调β-catenin可以恢复由下调Annexin A2所致的卵巢癌细胞的增殖、侵袭能力的下降,Annexin A2可能通过β-catenin发挥生物学作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.31

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