miR-320在乳腺癌中的作用及机制研究

发布时间：2018-03-30 15:51

本文选题：乳腺癌　切入点：预后预测　出处：《天津医科大学》2017年博士论文

【摘要】：背景:乳腺癌是女性最常罹患的恶性肿瘤,虽然随着早期筛查和治疗方案的进步其发病率和致死率较多年前已有所下降,但其仍然是威胁着女性身心健康主要疾病。乳腺癌发生发展相关基因的研究有助于发现新的预后预测标志和治疗靶点。近些年许多研究表明,miRNA的改变对于乳腺癌的发生、发展及预后发挥着至关重要的作用。因此,miRNA是乳腺癌早期诊断和治疗及患者预后预测的潜在标志物,更有望成为乳腺癌患者应用分子靶向治疗的潜在靶点。目的:通过检测mIR-320在乳腺癌中的表达水平结合临床病例研究探讨miR-320与乳腺癌发生发展的关系及其作为分子标志物预测乳腺癌患者预后的临床价值。通过细胞学实验探讨miR-320对乳腺癌生物学行为的影响,进一步阐明miR-320调控乳腺癌细胞恶性转化的分子机制。方法:1.采用RT-qPCR方法检测180例乳腺癌组织及其中15例配对的癌旁正常乳腺组织miR-320表达水平,配对t检验用来比较miR-320在乳腺癌组织及配对的正常组织中的表达水平,卡方检验分析乳腺癌组织中miR-320表达水平与乳腺癌患者临床病理因素的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析miR-320表达水平与乳腺癌患者三年无病生存(3-year Disease-Free Survival,DFS)和三年总生存(3-year Overall Survival,OS)的关系,采用Cox比例风险回归模型分析miR-320作为分子标志物的预后预测价值;2.采用实时RT-qPCR方法检测不同乳腺癌细胞系中miR-320的表达水平,分析miR-320表达水平与肿瘤细胞生物学行为和恶性程度的关系;3.外源转染miR-320 mimcs/inhibitor分别使乳腺癌细胞过表达miR-320和沉默内源性miR-320表达,通过MTT和克隆形成实验观察miR-320对乳腺癌细胞增殖能力的影响,通过Transwell实验观察miR-320对乳腺癌细胞侵袭能力的影响,通过流式细胞术检测miR-320表达对乳腺癌细胞周期分布和凋亡的影响;4.通过生物信息学预测miR-320下游调控的靶基因,通过和双荧光酶报告系统结合定点突变技术分析miR-320对下游潜在靶基因SOX4的调节活性,通过RT-qPCR和Western blot检测miR-320对SOX4表达水平的影响;5.通过RT-qPCR和Western blot检测miR-320/SOX4表达对上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)标志物E-cadherin和Vimentin表达水平。结果:1.miR-320在乳腺癌组织中的表达低于配对癌旁正常组织(P0.001);miR-320低表达乳腺癌患者有较高的临床分期(P=0.043);miR-320低表达的乳腺癌患者较高表达患者预后差(P=0.025),且miR-320表达水平是预测乳腺癌患者3年无病生存(disease-free survival,DFS)的独立预测因素;2.miR-320在恶性程度较低的乳腺癌细胞MCF7和T47D中高表达,在恶性程度较高的乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-468和BT549中低表达;3.在MDA-MB-231细胞中过表达miR-320能抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力,并促进凋亡,在MCF7细胞中沉默miR-320表达能促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。流式细胞术显示在MDA-MB-231细胞中过表达miR-320能导致细胞周期G1期阻滞,在MCF7细胞中沉默miR-320表达能上调S期细胞比例;4.生物信息学分析miR-320下游调控的靶基因,结果显示SOX4 3’-UTR区含有miR-320潜在的结合位点;双荧光报告系统证明miR-320能降低SOX43’-UTR的活性;进一步结合位点突变技术发现,miR-320不能降低miR-320结合位点突变的SOX4 3’-UTR活性,在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过表达miR-320能降低SOX4 m RNA和蛋白的表达水平,在MCF7乳腺癌细胞中降表达miR-320能上调SOX4 m RNA和蛋白的表达水平;5.在MDA-MB-231乳腺癌细胞中过表达miR-320能下调间质标志物Vimentin,上调上皮标志物E-cadherin(CDH1)表达,在MCF7乳腺癌细胞中降表达miR-320能下调上皮标志物E-cadherin,上调间质标志物Vimentin表达;6.TGF-β1作用乳腺癌细胞系MCF7后,miR-320表达下调。此外,过表达miR-320抑制MCF7乳腺癌细胞系中TGF-β1导致的促侵袭作用。结论:1.miR-320表达下调是乳腺癌患者早发转移和分化差的分子标志物,且与乳腺癌患者预后相关,但不是预后预测的独立因素;2.miR-320通过抑制SOX4表达抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭能力;3.miR-320通过调控SOX4表达抑制乳腺癌细胞EMT表型。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

【参考文献】