NASH中自噬通过TRAF6介导的泛素化抑制Kupffer细胞NLRP3炎症小体激活机制的研究

发布时间：2018-04-02 22:40

本文选题：非酒精性脂肪性肝病　切入点：自噬　出处：《重庆医科大学》2017年博士论文

【摘要】：第一部分NLRP3炎症小体和自噬在NASH患者和小鼠肝脏中的表达目的:收集非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)患者肝组织标本,建立NASH小鼠模型,观察NLRP3炎症小体和自噬在NASH患者和小鼠肝脏中表达和激活水平的变化。方法:(1)术中收集NASH患者的肝组织标本和肝脏相对正常患者肝脏标本,苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining,HE)及油红染色并通过NAFLD活动度评分标准将患者分为Ctrl组和NASH组,比较两组患者血清甘油三酯、游离脂肪酸(Free fatty acid,FFA)和白细胞介素-1β(imerleukin-1β,IL-1β)的水平以及NLRP3炎症小体和自噬相关蛋白的表达水平。(2)用HFD喂养小鼠建立NASH小鼠模型,并给予短期饥饿处理,HE染色及油红染色观察肝组织病理变化,透射电镜观察自噬小体激活情况,Western Blot(WB)检测小鼠肝脏及Kupffer细胞(KCs)中NLRP3炎症小体和自噬相关蛋白的表达水平。结果:(1)HE染色和电镜可见NASH患者肝细胞有大量脂滴聚集,呈气球样变,NASH患者肝脏的P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平较正常肝组织有明显升高(P0.01);LC3I向LC3II的转化水平以及Beclin-1表达水平较正常组降低(P0.05)。(2)HE染色和油红染色见NASH小鼠肝脏脂滴大量聚集,炎症细胞浸润;WB显示NASH小鼠肝脏的P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白表达水平较正常肝组织有明显升高(P0.01);电镜和WB提示NASH小鼠肝脏自噬水平下降。WB结果提示短期饥饿组自噬相关蛋白表达较HFD组恢复,NLRP3炎症小体激活减少。NASH患者和NASH小鼠血清IL-1β表达水平显著增加(P0.01)。结论:NASH患者和NASH小鼠肝脏的NLRP3炎症小体蛋白较正常肝脏表达升高,自噬相关蛋白表达水平下降。NASH患者和NASH小鼠血清IL-1β表达水平增加。NASH小鼠经短期饥饿处理后自噬功能有所恢复,NLRP3炎症小体激活有所减少。第二部分:激活自噬对Kupffer细胞中NLRP3炎症小体激活的影响目的:探讨在棕榈酸(Palmitic acid,PA)刺激下的KCs中,不同激活水平的自噬对NLRP3炎症小体激活和IL-1β分泌的影响。方法:分离培养KCs随机分为6组:Ctrl组,普通培养基;DMSO组,含DMSO培养基;PA组,0.5m M PA刺激12h;PA+雷帕霉素组(PA+R),50μM雷帕霉素预刺激4h后0.5m M PA刺激12h;PA+渥曼青霉素组(PA+W),50μM渥曼青霉素预刺激4h后0.5m M PA刺激12h;PA+饥饿组(PA+STAR),不含胎牛血清的DMEM培养4h后0.5m M PA刺激12h。收集细胞及上清液,电镜和激光共聚焦显微镜观察细胞形态及自噬小体形成情况,WB与q PCR检测LC3、P62、Beclin-1、NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白和相关基因的表达,ELISA检测细胞上清液IL-1β水平。结果:(1)透射电镜可见PA组KCs胞质中有双层膜结构的自噬体形成。PA+W组细胞中脂滴体积较大,自噬小体较少。PA+R组细胞中自噬小体增多,脂滴体积较小。(2)m RFP-EGFP-LC3双荧光标细胞显示PA组自噬流增加;PA+R组自噬流增强;PA+W组明显减弱。(3)WB结果显示,PA组LC3II/LC3I和Beclin-1的表达都较Ctrl组有明显增加(P0.01);P62,NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达与Ctrl组相比也有显著升高(P0.01)。PA+W组LC3II/LC3I和Beclin-1的表达较PA组明显减弱(P0.01);NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达与PA组比较显著增加(P0.01),P62的表达比PA组增加也有统计学意义(P0.05)。PA+R组LC3II/LC3I和Beclin-1的表达与PA组没有明显差异(P0.05);P62、ASC和caspase-1蛋白的表达与PA组比较显著下降(P0.01),NLRP3的表达与PA组比较也无统计学差异(P0.05)。(4)q PCR结果显示,PA组ATG5、ATG7和Beclin-1的m RNA表达都较Ctrl组有明显增加(P0.01);P62,NLRP3、ASC和caspase-1表达与Ctrl组相比也有显著升高(P0.01)。PA+W组ATG5、ATG7和Beclin-1的表达较PA组减弱(P0.05);P62、NLRP3、ASC和caspase-1的m RNA表达与PA组比较增加(P0.05)。PA+R组ATG5、ATG7和Beclin-1的表达与PA比较明显增加(P0.05);P62、NLRP3、ASC和caspase-1蛋白的表达与PA组比较下降。(5)ELISA结果示:PA组IL-1β水平较Ctrl组升高(P0.01)。PA+W组IL-1β水平较PA组明显升高(P0.01);PA+R组IL-1β水平较PA组显著降低(P0.01)。结论:PA刺激KCs使NLRP3炎症小体和自噬激活增加。用雷帕霉素激活自噬,可以抑制NLRP3炎症小体的激活,以及IL-1β的分泌。相反,用渥曼青霉素抑制自噬,则促进NLRP3炎症小体的激活和IL-1β分泌。第三部分:肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6,TRAF6)通过泛素化介导自噬对NLRP3炎症小体激活的调控目的:探讨PA刺激下自噬和NLRP3炎症小体互相作用机制,以及TRAF6在其中的作用。方法:激光共聚焦显微镜观察NASH患者和NASH小鼠肝脏自噬相关蛋白和炎症小体相关蛋白的共定位;免疫共沉淀检测PA刺激前后ASC蛋白与LC3、Beclin-1、P62的互相作用关系;WB检测PA刺激前后ASC泛素化水平;构建载有TRAF6-sh RNA的慢病毒质粒沉默TRAF6,用免疫共沉淀和WB检测沉默TRAF6后ASC泛素化水平的变化。结果:激光共聚焦显微镜观察在NASH患者和NASH小鼠肝脏存在自噬和炎症小体共定位;免疫共沉淀结果显示PA刺激后ASC蛋白与LC3、Beclin-1、P62形成共聚体的量较刺激前增加;WB检测结果表明,PA刺激后ASC总泛素化、K63泛素化和K48泛素化水平都增强;慢病毒沉默TRAF6后发现ASC总泛素化、K63泛素化和K48泛素化水平较PA组下降,且以K63泛素化下降为主。结论:PA刺激下,LC3与NLRP3炎症小体形成的共聚体的量较刺激前明显增加,P62与NLRP3炎症小体形成的共聚体的量也较刺激前明显增加,K63和K48泛素化可能参与其中。TRAF6在一定程度上调控对ASC的K63泛素化,促进P62将泛素化的ASC识别,进而转运至自噬体降解。
[Abstract]:Methods : ( 1 ) To investigate the expression of NLRP3 inflammatory and self - autophagy - related proteins in NASH patients and mice . Methods : ( 1 ) To observe the changes of expression and activation of NLRP3 inflammation bodies and autophagy in NASH patients . Methods : ( 1 ) The expression levels of serum triglyceride , free fatty acid ( FFA ) and interleukin - 1尾 ( imerthiazol - 1尾 , IL - 1尾 ) in liver tissues and liver tissues of NASH patients were observed by Western Blot ( WB ) . Results : ( 1 ) The levels of serum triglyceride , free fatty acid ( FFA ) and interleukin - 1尾 ( imercer - 1尾 , IL - 1尾 ) in liver and liver of mice were observed by Western Blot ( WB ) . The levels of serum IL - 1尾 in NASH and NASH mice were significantly increased ( P0.01 ) . Compared with the control group , the expression of ATG5 , ATG7 and Beclin - 1 in PA + R group was significantly higher than that in the control group ( P0.01 ) . The levels of IL - 1尾 and IL - 1尾 in the patients with NASH and NASH were significantly higher than those in PA group ( P0.01 ) .

【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R575

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