表达HMGN2融合蛋白的重组T细胞对肿瘤细胞杀伤作用的探索

发布时间：2018-04-04 16:04

  本文选题：高迁移率族蛋白N2　切入点：嵌合抗原受体　出处：《郑州大学》2017年博士论文

【摘要】：背景尽管手术、放疗和化疗治疗恶性肿瘤在降低患者死亡率,提高生活质量方面取得了一定的进展。但是,手术治疗易复发,放、化疗毒副作用大,不良反应较多,患者在治疗过程中需承受巨大痛苦仍然难以治愈。近年来,应用改造的淋巴细胞做细胞免疫治疗取得了巨大的成功。这些免疫治疗的设计都是给肿瘤患者输注体外激活的淋巴细胞,希望进入体内的淋巴细胞能够杀伤和清除肿瘤细胞。免疫治疗的方式也在治疗实践中一步一步的发展和改进,从最初的培养肿瘤部位洗脱的TIL细胞,再到IL-2刺激生长的LAK细胞,用多种细胞因子刺激的CIK细胞,用肿瘤抗原肽激活的CTL细胞等等。这些免疫疗法效果都有限。直到近年出现的嵌合抗原受体T细胞(CAR T),细胞免疫治疗才真正进入了临床肿瘤治疗的阶段。分析CAR T细胞取得成功的原因,是其初步解决了2个关键性问题,一是以往培养后获取的有活性的淋巴细胞难以在体内大量生长,不能持续发挥抗肿瘤作用。CAR T细胞改造中给T细胞引入T细胞受体嵌合序列CD8A-CD28-CD137-CD3ζ,诱导其在体内外都能大量扩增,长期存活。二是给T细胞装备识别肿瘤的眼睛,能够特异性识别肿瘤抗原。以目前临床最有成效的CD19-CAR T来说,其T细胞受体识别抗原肽的片段改装为抗CD19抗体,急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病细胞都有CD19抗原,可以被特异性识别和杀伤。尽管有此成就,CAR T细胞的缺陷也开始显现。在临床抗肿瘤过程中致死性的细胞因子风暴、耐药性和脱靶效应等问题也逐渐出现,尤其CD19-CAR T细胞,除杀伤CD19+白血病细胞外还杀伤正常B淋巴细胞,引起低免疫球蛋白血症,是最终导致患者感染死亡的重要隐患。究其原因,是迄今并未找到急慢性淋巴细胞白血病特异性标志物,治疗设计只是针对白血病细胞经常出现的CD19抗原,而CD19抗原也出现在正常B细胞上。目前细胞免疫治疗迫切需要肿瘤细胞的特异性标志物。本文发现,高迁移率族蛋白N2(High Mobility Group Chromosal Protein N2,HMGN2)是一个值得关注的蛋白。HMGN2对乳腺癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞具有趋向性和特异性结合识别能力,同时也可增强细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞等免疫细胞的抗肿瘤效应。本文拟构建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合基因慢病毒载体,转染制备重组的T细胞(简称HMGN2-T细胞),观察其抗肿瘤潜力。目的探索表达HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白的HMGN2-T细胞是否能获得体外大量增殖及特异性杀伤肿瘤细胞的功能,有用于临床肿瘤治疗的可能性。方法1.构建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白相关基因。收集正常人外周血,提取单个核细胞的总RNA,逆转录成c DNA,设计引物应用PCR分别扩增特异性肿瘤细胞粘附分子HMGN2、跨膜区和铰链区CD8A、胞内共刺激信号区CD28和CD137、信号传导区CD3ζ5个基因编码区全长,凝胶纯化目的基因DNA。将HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ5个基因进行TA克隆,挑菌落进行培养测序。将测序正确的菌落重新培养,提取纯化质粒DNA。2.利用分子生物学技术将HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ的编码序列按顺序连接起来,构建HMGN2融合基因重组质粒载体,PCR和基因测序技术鉴定重组基因序列完全正确后进行慢病毒包装、浓缩纯化及病毒滴度测定。使其可以合成HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重组融合蛋白。3.用慢病毒包装HMGN2融合基因经感染Jurkat细胞制备HMGN2-T细胞。应用荧光显微镜、流式细胞术检测HMGN2融合蛋白在HMGN2-T细胞和转染空质粒Jurkat细胞的表达情况。测定HMGN2-T细胞增殖能力,包括CCK-8法检测HMGN2-T细胞增殖能力;ELISA法检测HMGN2-T细胞细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌情况;流式细胞术Annexin v-PE/7-AAD双染法检测HMGN2-T细胞凋亡情况;流式细胞术PI单染法检测HMGN2-T细胞周期DNA含量改变。4.HMGN2-T细胞与肿瘤细胞共培养过程中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平发生改变以及抗肿瘤作用。ELISA法检测HMGN2-T细胞在抗肿瘤过程中细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ分泌水平的改变。用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验检测HMGN2-T细胞分别与宫颈癌Hela细胞系、肺癌LLC细胞系、肝癌Hep G2细胞系、乳腺癌MCF7细胞系共培养过程中的杀伤能力。结果1从正常人外周血基因组RNA中获得了HMGN2、CD8A、CD28、CD137、CD3ζ5个基因并构建完整质粒从正常人外周血提取单个核细胞,提取总RNA逆转录成c DNA,应用PCR技术分别扩增出特异性肿瘤细胞粘附分子HMGN2(273bp)、跨膜区和铰链区CD8A(708bp)、胞内共刺激信号区CD28(663bp)和CD137(768bp)、信号传导区CD3ζ(492 bp)5个基因编码区全长,凝胶纯化DNA。将纯化后的DNA通过分子克隆技术分别构建HMGN2-p GM-T、CD8A-p GM-T、CD28-p GM-T、CD137-p GM-T、CD3ζ-p GM-T质粒载体,挑克隆基因测序正确。HMGN2融合蛋白慢病毒2重组HMGN2融合蛋白GV358质粒并获得能用于转染T细胞的应用PCR技术将5个基因进行连接,构建HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ(2880bp)GV358质粒载体,挑克隆基因测序正确。将新合成的HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重组融合蛋白命名为HMGN2融合蛋白。采用GV358载体、Helper 1.0载体、Helper 2.0载体共转染293T细胞,72h后收集细胞上清液,离心浓缩去除杂质后进行慢病毒的浓缩和纯化。检测HMGN2融合蛋白慢病毒滴度结果为1×108Tu/ml,HMGN2融合蛋白慢病毒转染293T细胞72小时后在倒置荧光显微镜下拍照,见到携带大量绿色荧光的细胞,且细胞荧光率达70%以上;PCR扩增出HMGN2融合蛋白目的基因全长,说明慢病毒包装成功,可以进行HMGN2融合蛋白功能测定。3慢病毒包装HMGN2融合基因转染Jurkat细胞制备HMGN2-T细胞用包装HMGN2融合基因的慢病毒感染Jurkat细胞,成功制备了表达HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ融合蛋白的重组T细胞(简称HMGN2-T细胞)。培养72h后在普通显微镜下观察,可以见到HMGN2-T细胞折光性强,生长状态良好。荧光显微镜下看到大量HMGN2-T细胞携带绿色荧光,对照组未转HMGN2融合基因的Jurkat细胞为阴性。流式细胞术检测HMGN2融合基因转染Jurkat细胞获得HMGN2-T细胞的成功率达78.33%。提取HMGN2-T细胞和转染空质粒的Jurkat细胞的总RNA,逆转录成c DNA,进行PCR,HMGN2-T细胞可扩增出HMGN2融合蛋白基因全长,基因测序正确;转染空质粒的Jurkat细胞为阴性。应用CCK-8法检测HMGN2-T细胞在24h、48h、72h细胞增殖作用。分别与未转染病毒的Jurkat细胞和转染空质粒的Jurkat细胞相比,HMGN2-T细胞在24h增殖作用(0.404±0.075)与对照组(0.363±0.103,0.371±0.097)相比没有明显差别(P=0.499),但在48h、72h的增殖作用(0.787±0.206,0.931±0.273)与对照组相比有明显增强,增殖速率分别为48.66%、56.60%,说明HMGN2-T细胞增殖作用增加,并且随着时间延长HMGN2融合蛋白可显著促进HMGN2-T细胞增殖(P=0.001)。4 HMGN2-T细胞的细胞因子IL-2,TNF-α分泌增多,IFN-γ分泌水平无改变应用ELISA法检测HMGN2-T细胞不同时间点细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ分泌情况。实验结果表明HMGN2-T细胞在24h、48h细胞因子IL-2的分泌量(1054.205±94.815,1680.705±119.437)pg/ml要明显高于未转染病毒的Jurkat细胞(795.25±16.263,882.735±36.790)pg/ml和转染GV358空质粒的Jurkat细胞(540.46±8.188,801.735±25.434)pg/ml在相同时间点的分泌水平(P0.05),随着时间延长HMGN2-T细胞IL-2分泌量以1.5倍的速度增长(P=0.009)。HMGN2-T细胞在24h、48h细胞因子TNF-α的分泌量(305.373±16.598,662.534±48.485)pg/ml要明显高于未转染病毒的Jurkat细胞(164.408±16.519,348.421±12.517)pg/ml和转染GV358空质粒的Jurkat细胞(270.701±18.990,271.977±4.917)pg/ml在相同时间点的分泌水平(P0.05),HMGN2-T细胞IL-2,TNF-α分泌水平都有随着时间逐渐增多的趋势。HMGN2-T细胞IFN-γ在48h的分泌水平(1040.59±174.259,1013.652±84.402,1042.767±117.305)pg/ml在三组之间无明显改变(P=0.991),且在不同时间点无差异性改变(P=0.764)。5 HMGN2-T细胞增殖速率明显增加,凋亡代谢率增快应用流式细胞术PI单染法检测HMGN2融合蛋白在转染Jurkat细胞24h、48h后细胞周期DNA含量改变。HMGN2-T细胞与转染GV358空质粒的Jurkat细胞在转染后24h相比,G0/G1期细胞减少13.63%(38.926%±0.628 VS 52.556%±5.408),S期细胞增加15.1%(55.94%±2.032 VS 40.846%±7.387),G2/M期细胞变化不明显(5.133%±1.532 VS 6.6%±1.992);转染后48h HMGN2-T细胞与转染GV358空质粒的Jurkat细胞相比,G0/G1期细胞减少8.72%(41.393%±3.425 VS50.116%±8.575),S期细胞增加2.14%(47.3%±12.708 VS 45.163%±6.475),G2/M期细胞增多1.92%(6.663%±3.133 VS 4.716%±2.511),说明转染HMGN2融合蛋白的Jurkat细胞与对照组相比,G0/G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞增多,细胞增殖速率明显增加。流式细胞术Annexin v-PE/7-AAD双染法检测HMGN2-T细胞24h、48h凋亡率的改变。HMGN2-T细胞与转染GV358空质粒的Jurkat细胞相比较(7.02%VS3.57%,6.34%VS 0.84%),凋亡率分别增加3.45%和5.5%,有明显差别(P=0.001),但HMGN2-T细胞在两个时间点的凋亡情况(7.28%±0.99 VS 6.5%±0.72)无明显改变(P=0.457)。6 HMGN2-T细胞在抗肿瘤过程中较多分泌TNF-α,IFN-γ,可以直接杀伤宫颈癌、肺癌、肝癌、乳腺癌细胞,应用ELISA法检测HMGN2-T细胞分别与Hela细胞、LLC细胞、Hep G2细胞、MCF7细胞共培养过程中细胞因子IL-2,TNF-α,IFN-γ分泌情况。IL-2在Hela细胞、LLC细胞、Hep G2细胞、MCF7细胞中的分泌水平分别与对照组相比(2270.5±994.8 VS 1729±490.7,2997.5±1010.4 VS 2802.5±1115.1,3112.5±620.1VS 2371±677.4,3221.5±615.89 VS 3596.5±453.2)pg/ml没有显著性差异(P0.05);TNF-α分泌水平在LLC细胞(4332.5±887.4)pg/ml,MCF7细胞(3611.5±1511.0)pg/ml和Hep G2细胞(6256±660.4)pg/ml中分别与对照组相比(2167.5±498.5,1116±237.5,3556.5±1004.7)pg/ml有明显增高,但在Hela细胞中(3002.5±306.1VS 2282±395.9)pg/ml变化水平没有统计学差异(P0.05);IFN-γ分别在LLC细胞、MCF7细胞、Hela细胞、Hep G2细胞中分泌水平与对照组相比较(18744.5±1545.0 VS 6781±1176.6,12852±3364.4 VS 4374±1347.7,15037.5±4850.0 VS 3348±750.9,14282.5±760.1 VS 7332.5±1921.2)pg/ml有显著的增高,结果说明,HMGN2-T细胞对Hela细胞、LLC细胞、Hep G2细胞、MCF7细胞有明显的杀伤作用,并且在杀伤过程中主要以分泌TNF-α,IFN-γ为主。LDH细胞毒实验检测HMGN2-T细胞与宫颈癌Hela细胞、肺癌LLC细胞、肝癌Hep G2细胞、乳腺癌MCF7细胞共培养过程中的杀伤作用。在LLC细胞,HMGN2-T细胞与对照组效靶比在1:1的杀伤率(5.62±1.45 VS 8.92±3.47)%无差异,从5:1、10:1、15:1、20:1开始,HMGN2-T细胞对LLC细胞特异性杀伤率(22.33±4.75 VS 3.95±6.73,23.60±6.58 VS 3.81±1.07,43.81±5.73 VS 5.27±0.90,55.34±3.45 VS 3.81±1.89)%与对照组相比有明显差异,且随着效靶比例增加,杀伤作用逐渐增强;效靶比从5:1起,在MCF7细胞的特异性杀伤率(18.23±3.47,32.67±7.44,58.78±16.51,66.74±8.38)%,Hela细胞的特异性杀伤率(13.29±5.45,21.89±5.54,47.74±4.04,57.81±3.37)%,Hep G2细胞的特异性杀伤率(19.58±5.22,29.57±10.17,56.22±10.26,64.18±25.30)%与对照组相比有明显差异(P0.05),当效靶比增加到20:1时,HMGN2-T细胞分别对Hela细胞、LLC细胞、Hep G2细胞、MCF7细胞的特异性杀伤功能可达到55.4%、66.4%、57.8%、64.1%。结论HMGN2-CD8A-CD28-CD137-CD3ζ重组基因慢病毒载体感染Jurkat细胞可以制备HMGN2-T细胞。HMGN2-T细胞体外增殖作用显著增加,可以直接杀伤宫颈癌、肺癌、肝癌、乳腺癌细胞,有作为新型细胞免疫疗法的临床应用潜力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R730.51

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本文编号：1710671